Omentin-1蛋白真核表达及其纯化

Omentin-1 蛋白真核表达及其纯化背景:网膜素 1(Omentin-1)是一种新型脂肪因子,主要由内脏脂肪组织中间质血管细胞表达。Omentin-1 也曾被称为内凝集素 1(intelectin-1,ITLN1)、肠乳铁蛋白受体、内皮凝集素 HL-1 或呋喃半乳糖结合凝集素。讨论发现,Omentin-1 参加维持机体能量平衡、葡萄糖代谢、心血管保护、抗炎、氧化应激和神经细胞功能调控等生理病理过程,与肥胖症、糖尿病、动脉粥样硬化、心血管疾病、肿瘤和脑梗死等疾病的发生进展密切相关。重组Omentin-1 蛋白作为 Omentin-1 功能验证及探究其在相关疾病中作用机制的重要工具受到讨论者们的广泛关注。由于血浆中存在的 Omentin-1 蛋白为三聚体状态,而目前商品化的 Omentin-1 蛋白多为原核生物表达,蛋白结构并不能满足这一特性。为最大程度模拟血浆Omentin-1 蛋白的生物活性,进一步解析 Omentin-1 蛋白的生理病理功能,获得Omentin-1 三聚体蛋白具有重要意义。目的:建立 Omentin-1 蛋白真核表达系统,纯化真核表达系统表达的Omentin-1 蛋白,并完成纯化 Omentin-1 蛋白的相对分子质量、纯度及浓度的鉴定。方法:在基础载体 pEGFP-N1(4733bp)上构建相对分子质量大小相似的 Flag-ITLN1(4905bp)和 ITLN1-Flag(4896bp)两种质粒,双酶切实验和 DNA 测序完成质粒鉴定。以 pEGFP-N1 质粒转染 HEK 293 细胞后的荧光强度优化转染条件。Flag-ITLN1(4905bp)和 ITLN1-Flag(4896bp)以优化后的转染条件转染 HEK 293 细胞,并设置 pEGFP-N1 质粒转染孔评估转染效率,建立 Omentin-1 真核表达系统。定量逆转录聚合酶链式反应(quantative reverse transcription-PCR,qRT-PCR)检测质粒转染后(24h)HEK 293 细胞 Omentin-1 基因表达量差异,蛋白质印迹法(western blotting,WB)检测质粒转染后(48h)HEK 293 细胞培育液中 Omentin-1 蛋白表达量差异,筛选出 Omentin-1 蛋白表达量相对较高的Omentin-1 蛋白真核表达系统。收集所建立的 Omentin-1 蛋白真核表达系统的细胞培育液,采纳二苯基砜树脂耦连法完成对细胞培育液中 Omentin-1 蛋白的纯化,分别运用截留分子量为 30kDa、100kDa 的超滤管分离混杂蛋白,SDS-PAGE 凝胶电泳对纯化的 Omentin-1 蛋白进行相对分子质量和纯度鉴定,WB 及质谱对纯化的Omentin-1 蛋白进行定性鉴定,BCA 法测定纯化的 Omentin-1 蛋白浓度。结果:1.Flag-ITLN1 质粒转染 HEK 293 细胞后细胞 Omentin-1 基因、培育液中 Omentin-...