附件 3化妆品用化学原料体外兔角膜上皮细胞短时暴露试验Short Time Exposure In Vitro Test Method (STE)1 范围本方法规定了化妆品用化学原料体外兔角膜上皮细胞短时暴露试验的范围、试验目的、术语和定义、试验原理、试验材料与试剂、试验步骤、结果判定标准。本方法适用于化妆品用化学原料眼刺激性的检测。2 试验目的预测和评价化妆品用化学原料对眼睛是否具有刺激作用或腐蚀作用。3 术语和定义下列术语和定义适用于本方法。3.1 眼睛刺激性 eye irritation眼球表面接触受试物后所产生的可逆性炎性变化。3.2 眼睛腐蚀性 eye corrosion眼球表面接触受试物后引起的不可逆性组织损伤。3.3 细胞活性 cell viability在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，活细胞所占细胞总数的百分比称为细胞活性。参数的选择及其数值取决于测定的终点和试验所用的设计方案。3.4 相对细胞活性 relative cell viability通过与溶剂（阴性）对比组的相关性来表达的细胞活性，对比组除了未经受试化学物质处理外，整个试验过程与试验组一样。4 试验原理化合物直接作用于角膜引起的刺激作用类似于细胞毒性损伤作用通过检测细胞毒性指标，可反映角膜损伤的程度。试验采纳体外培育的兔角膜上皮细胞（SIRC），短时暴露于化妆品用化学原料，模拟急性角膜刺激作用，通过计算细胞相对存活率来预测化妆品用化学原料引起的眼睛损伤。5 试验材料与试剂5.1 细胞株采纳 SIRC 兔角膜上皮细胞，该细胞为贴壁生长。要求：来源清楚，代数明确（<25 代）。5.2 培育基采纳 MEM 培育基，加入 10%胎牛血清、2mmol/L 谷氨酰胺和适量抗生素（终浓度为青霉素 50～100IU/mL，链霉素 50～100μg/mL）。5.3 溶液的配制0.5mg/ mL 噻唑蓝（MTT）溶液：称取 MTT 50mg，溶于 100 mL的磷酸盐缓冲液或无酚红的培育基中，用 0.22μm 滤膜过滤除菌，放4℃避光保存，最好现用现配。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。0.04N 酸化异丙醇：异丙醇中加入 HCl 使其最终达 0.04mol/L。磷酸盐缓冲液(PBS)：氯化钠 9.00g、七水磷酸氢二钠 0.73g、无水磷酸二氢钾 0.21g，去离子水定容至 1000 mL，调 pH=7.2～7.4，高压灭菌。5.4 溶剂的选择假如受试物为水溶性物质首选生理盐水作为溶剂，若受试物不能溶解或均匀混悬于生理盐水中则可首先考虑 5%的 DMSO/生理盐水溶液，其次可选用矿物油作为溶剂。不能溶于或均匀混悬于上述三种溶剂的物质不...
