皮肤变态反应-局部淋巴结试验DAVIP专享

附件 4皮肤变态反应：局部淋巴结试验:DASkin Sensitization: Local Lymph Node Assay: DA（LLNA:DA）1 范围本方法规定了局部淋巴结试验（LLNA:DA）的基本原则和试验要求。本方法适用于化妆品用化学原料皮肤变态反应的检测。2 试验目的确定重复接触化妆品用化学原料对哺乳动物皮肤局部是否可引起变态反应及其程度。3 定义3.1 皮 肤 变 态 反 应 （ 过 敏 性 接 触 性 皮 炎 ） skin sensitization，allergic contact dermatitis皮肤对一种物质产生的免疫源性皮肤反应。在人类这种反应可能以瘙痒、红斑、丘疹、水疱、融合水疱为特征动物的反应不同，可能只见到皮肤红斑和水肿。3.2 皮肤刺激性 dermal irritation皮肤涂抹受试物后局部产生的原发可逆性炎性变化。3.3 刺激指数 stimulation index评价受试物皮肤致敏能力的值，是试验组与溶剂对比组增殖率的比值。4 试验原理过敏原引起染毒部位回流淋巴结内淋巴细胞增殖，其增殖程度与过敏原的剂量和效力成比例。通过生物发光法测定耳廓淋巴结内淋巴细胞 ATP 含量（与活细胞数相关）从而评价其增殖程度。生物发光法利用荧光素酶（luciferase）催化 ATP 和荧光素（luciferin）反应同时发光，其发光强度与 ATP 浓度线性相关。通过计算受试物组与溶剂对比组 ATP 含量比值即刺激指数评价受试物的皮肤致敏性。ATP+Luciferin+O2Luciferase→Oxyluciferin+AMP+ PPi+CO2+Light5 试验的基本原则5.1 实验动物和饲养环境选用 SPF 级 BALB/c 或 CBA/J 小鼠，8～12 周龄，雌性，未孕或未曾产仔的。体重差异应不超过平均体重的 20%。其他品系或雄性小鼠如经验证 LLNA:DA 反应不存在明显品系或性别间差异亦可使用。实验动物及实验动物房应符合国家相应规定，选用标准配合饲料，饮水不限制。5.2 动物试验前准备试验前动物应在实验动物房环境中至少适应 5d。将动物随机分组标记（不要做任何形式的耳朵标记），检查皮肤应健康无损伤。试验开始和结束时应记录动物体重。5.3 可靠性检查每次试验均需设置阳性对比组，阳性物一般采纳 25%己基肉桂醛（CAS 号 101-86-0）或 25%丁子香酚（CAS 号97-53-0），溶剂为丙酮：橄榄油（AOO，4:1，v/v）。当阳性物与受试物的溶剂不同时，需另单独设置阳性物的溶剂对比组。5.4 试验期间每天观察动物临床症状及耳朵局部刺激症状，并做完整记录。6 试验方法进行本试验前，需通过预试验（每组 1～2 只动物）排除受试物...