Cisbio—HTRF®技术原理和应用简介HTRF®（均相时间分辨荧光,Homogeneous Time—Resolved Fluorescence ）是一种用来检测纯液相体系中待测物的技术。该技术基于荧光共振能量转移（ FRET,Fluorescence Resonance Energy Transfer）和时间分辨荧光（TRF, Time-Resolved Fluorescence））两大技术，开通的一款高通量药物筛选利器。荧光共振能量转移（FRET）利用两种荧光基团的能量转移，这两种荧光基团分别称为能量供体(Donor）和能量受体（Acceptor）。Donor 被外来光源激发（例如氙灯或激光），假如它与 Acceptor 比较接近，可以将能量共振转移到在 Acceptor 上，使其受到激发，发出特定波长的发射光。将 Donor 和 Acceptor 分别与相互作用的两个生物分子结合,生物分子的结合可以将 Donor 和Acceptor 拉到足够近的距离，产生能量转移,由于 Acceptor 的发射光来自能量转移，所以实验中不需要将未结合与已结合的分子分开，即不需要洗涤步骤. 时间分辨荧光(TRF）TRF 利用稀土元素中镧系元素的独特性质，它们与普通荧光的主要区别是荧光的持续时间不同。普通荧光的半衰期为纳秒级。镧系元素的半衰期为毫秒级，有 6 个数量级的差别.所以，在检测室,TRF 有一个时间延迟--—50us，经过这个时间延迟,普通荧光的信号几乎为零,所以，TRF 的背景非常低,反映样品实际情况。HTRF®的能量受体（技术创新点）HTRF®的能量供体是铕（Eu)和钛(Tb）的穴状化合物。在这个穴状化合物里，Eu 和 Tb 被永久地嵌合在一个笼子里，结构非常稳定,这个结构由 J。M。Lehn’s 教授发明的,并由此在 1987 年获得了诺贝尔奖.HTRF®的能量受体HTRF®的能量受体也有二种，XL665 和 d2.它们的光学性质相同，分子量不同，前者分子量为10KD，实际上就是别藻蓝蛋白(APC)。我们将 APC 的亚基偶联在一起，使其不能解离，提高了稳定性,后者分子量为 1KD，在某些实验中有独特的优势.HTRF®的操作步骤HTRF®操作步骤非常简单，只需要将实验所需试剂加进去，然后孵育，检测即可。HTRF®实验数据分析HTRF®采纳了比值法来处理数据，可以去除溶液通透率、细胞大小、细胞数量不同引起的误差。HTRF®应用范围G 蛋白偶联受体讨论激酶活性检测生物标志物检测受体第二信使检测受体配体结合胞内信号分子检测胞外激酶活性检测 胞内激酶活性检测 基于抗体的夹心法和竞争法检测抗体检测生物/免疫过程分析免疫检查点检测抗体重链含量检测抗体轻链含量测定 GST ...
