SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理和操作步骤

SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤实验原理:SDS—PAGE 是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。SDS 是一种去垢剂,可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构,并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。SDS 蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。试剂和器材：试 剂 ： 1. 5x 样 品 缓 冲 液 （ 10ml ） :0.6ml 1mol/L 的 Tris-HCl（pH6.8）,5ml 50%甘油，2ml 10%的 SDS,0.5ml 巯基乙醇，1ml 1％溴酚蓝，0。9ml 蒸馏水。可在 4℃保存数周，或在－20℃保存数月。2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺 30g，甲叉双丙烯酰胺 0.8g，加重蒸水溶解后，定容到 100ml。过滤后置棕色瓶中，4℃保存,一般可放置 1 个月。3。 pH8.9 分离胶缓冲液: Tris 36。3g ，加 1mol/L HCl 48ml，加重蒸水 80ml 使其溶解,调 pH8。9，定容至 100ml, 4℃保存。4。 pH6.7 浓缩胶缓冲液: Tris 5。98g ，加 1mol/L HCl 48ml，加重蒸水 80ml 使其溶解，调 pH6.7，定容至 100ml, 4℃保存。5. TEMED（四乙基乙二胺）原液6.10％过硫酸铵（用重蒸水新奇配制）7。 pH8.3 Tris—甘氨酸电极缓冲液：称取 Tris 6。0g，甘氨酸28。8g，加蒸馏水约 900ml,调 pH8。3 后，用蒸馏水定容至1000ml.置 4℃保存，临用前稀释 10 倍。8。 考马斯亮蓝 G250 染色液：称 100mg 考马斯亮蓝 G250，溶于 200ml 蒸馏水中，慢慢加入 7。5ml 70％的过氯酸，最后补足水到 250ml，搅拌 1 小时,小孔滤纸过滤.器材：电泳仪，电泳槽,水浴锅，摇床。 实验操作(一）样品制备将蛋白质样品与 5X 样品缓冲液（20ul＋5ul)在一个 Eppendorf管中混合。放入 100℃加热 5－10min，取上清点样。（二）分离胶及浓缩胶的制备 1 将玻璃板、样品梳、Spacer 用洗涤剂洗净,用 ddH2O 冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干;2 将两块洗净的玻璃板之间加入 Spacer，根据 Bio-Rad Mini /Ⅱ Ⅲ 说明书提示装好玻璃板;3 按如下体积配制 10％分离胶 8.0 ml,混匀；ddH2O 3.0 ml1.0 mol/LTris—HCl pH=8。8 2.1 ml30% Acr-Bis 2。8 ml10％ SDS 80 ul10%AP 56 ulTEMED 6 ul4 向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大...