transwell实验原理与步骤

一、Transwell 小室制备1。 无基质胶 Transwell 小室制备① 包被基底膜：用 50 mg/LMatrigel 1：8 稀释液包被 Transwell 小室底部膜的上室面，4 ℃风干。假如需要在下室面铺 FN 的话,可将 200 ul 枪头的尖端剪掉,吸取 FN 均匀涂抹在小室的下面。用胶原（collagen）的话，一般配成 0。5 mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。② 水化基底膜：吸出培育板中残余液体，每孔加入 50ul 含 10g/LBSA 的无血清培育液，37 ℃，30min。另有 tianjin_glioma 战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的 Matrigel (3.9 ug/ul） 60—80 µl (注意体积不可太大,以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置 37 ℃ 30 min使 Matrigel 聚合成凝胶。2. 有基质胶的 Transwell 小室制备 Chemicon 公司的 ECM550 系列说明书要求，将小室放入培育板中，在上室加入 300 µl预温的无血清培育基，室温下静置 15－30 min，使基质胶再水化。再吸去剩余培育液.二、制备细胞悬液① 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿 12－24 h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。② 消化细胞,终止消化后离心弃去培育液，用 PBS 洗 1－2 遍，用含 BSA 的无血清培育基重悬.调整细胞密度至 1-10×105，个人认为不要超过 5×105。具体实验时采纳密度要自己摸索,因为不同细胞,其侵袭能力是不同的。个人经验，细胞量过多,穿过膜的细胞会过多过快,假如最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话,可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。个人认为,对比组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果.假如需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次,力求准确,尽量保证对比组和处理组细胞密度一致。三、接种细胞① 取细胞悬液 100－200 µl 加入 Transwell 小室,不同公司的、不同大小的 Transwell 小室对细胞悬液量有不同要求,请参考说明书。24 孔板小室一般 200 µl。② 24 孔板下室一般加入 500 µl 含 FBS 或趋化因子的培育基，不同的培育板加的量有不同要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是,下层培育液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培育液的趋化作用就减弱甚至消逝了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培育板。③ 培育细胞：...