组织切片免疫组化-张VIP免费

第1页共7页编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第1页共7页组织切片免疫组化雄鼠肾囊膜移植EScell4-6周处死小鼠，1％多聚甲醛固定4℃保存（无限时），1.脱水50％乙醇30min60％乙醇30min70％乙醇过夜80％乙醇60min90％乙醇60min95％乙醇①20min95％乙醇②25min100％乙醇①20min100％乙醇②25min透明⑴以上每次移前快速用滤纸吸，但不能干，组织块轻夹，避免损伤，或者将组织快放在离心管中，依次加入不同浓度的乙醇，每次更换时，吸出大部分的乙醇，将剩余的连组织块倒在滤纸上，再立即反过来将组织块导入离心管，再加下一个浓度的乙醇）⑵液液之间误差约为1min，进入后摇晃2.透明100％乙醇＋苯（1：1）10min苯①过午苯②10min浸蜡3.浸蜡（62℃恒温箱,将组织块放在铁网中，挨个转移）蜡①10min蜡②20min蜡③20min4.包埋：石蜡盒底部事先用手指涂点甘油，石蜡未凝固时将组织块拟切面朝下中间放置，盖上镂空塑料托，石蜡凝固后，自来水，完全冷却后，将包埋盒与塑料托分离，组织块应该留在托一边，收藏好等待切片（避尘）【蜡若凝固于组织块外围，将器皿搁酒精灯上烤烤，化后移入温箱】【组织块由苯移入蜡时，瓶边靠上即可，不用滤纸，在蜡之间移动组织块要快，尽量避免凝固】【用苯替代二甲苯透明可放置较长时间，组织块不易脆】5.切片6.展片，贴片卧式染缸＋2/3蒸馏水+10滴蛋清甘油，混匀；将蛋清甘油水溶液摸匀载玻片上，磨砂面朝上；将玻片在酒精灯火焰上晃3-5下（夏天）或6-8下（冬天）用手术刀取一段适宜长度的切片，移到载玻片液滴上，光面朝下；用展片针将皱的组织展开用手术刀分开组织片段，移于另一载玻片（事先蛋清甘油水溶液滋润）中间；组织方向尽量保持一致（根据形状，或有绒毛的朝上）置于片盘上，做好标记；移入恒温箱前，不能让切片干掉，要保持适度湿润（否则切片烤后不牢），但切片周围尽量不要留有蛋清甘油，以免染色后影响片子美观；移入48℃恒温箱，烤片，过夜，2天都行。第2页共7页第1页共7页编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第2页共7页7.染色，封片1.脱蜡二甲苯①3min二甲苯②3min100％乙醇①5min100％乙醇②5min95％乙醇①5min95％乙醇②5min90％乙醇5min80％乙醇5min70％乙醇5min自来水3min蒸馏水3min染色（或修复，抗体，显色，如果作免疫组化不能用脱过伊红的酒精去脱水）苏木精7min（染色前将漂浮的氧化物用滤纸捞起，要慢放慢提，避免将沉淀悬浮起）自来水漂洗5min（置盆中流水冲洗，水不能直接冲在玻片上）酸酒精浸提N次（4次）（根据分色情况定）自来水漂洗5min（回色）漂洗前先用自来水洗一遍（漂洗后观察分色情况）蒸馏水3min伊红5min若置于90％酒精中褪色很快，往伊红中加200ml冰醋酸，搅匀，重复染色至深桃红（染色稳定后一般不再加冰醋酸）70％乙醇浸提80％乙醇浸提90％乙醇3min95％乙醇①5min95％乙醇②5min100％乙醇①5min100％乙醇②5min二甲苯＋100％乙醇（1：1）3min二甲苯①3min二甲苯②3min（浸在二甲苯中，一片封完取另一片）封片封片擦干二甲苯中性树胶滴于组织边盖玻片朝上一面酒精灯上晃一下（去水分）盖玻片一边小心置于树胶液滴外沿轻轻盖上（组织应在中间）置片盘晾干（片盘晾干）【从脱蜡起直至封片，注意组织片均不能干】【看片时，若是苏木精颜色有点发黑，说明透明时组织干了】【看片时，若发现杂质，一要注意苏木精染色时要去氧化物，染色时要轻放轻取，二要在自来水漂洗前将水龙头包上棉花，纱布过滤】免疫组化：修复柠檬酸缓冲液放在烧杯中，置于水浴中，当柠檬酸缓冲液温度达到95度时，将玻片放入柠檬酸缓冲液中，当温度达到92度开始计时92-98度30min，取出凉到室温，再将玻片取出，（柠檬酸缓冲液只能使用一次），我放置了2.5hr才取出。然后蒸馏水洗，PBS洗5min，3次，最后一次时间可长，1擦去玻片周围的水，放置在湿盒中，加B液，盖上湿盒；2再取另一片重复上一步，大约9片后计时15min；然后全部结束；3.时间到后，从第一片开始取出玻片用蒸馏水冲洗2-3次，放入浸在PBS的架子上，继续另一片；4．全部结束后计时5min，3次，期间提起架子混匀液体;5.最后一次洗涤...