第30讲微生物的利用[考纲要求]1.大肠杆菌的培养和分离。2.分离以尿素为氮源的微生物。考点一微生物的培养和分离1.培养基与无菌技术(1)培养基含义微生物生存的环境和营养物质成分①水、无机盐、碳源和氮源，还需满足不同微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求②LB培养基：蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、水、琼脂(固体培养基)各成分的作用蛋白胨、酵母提取物：为细菌生长提供碳源和氮源氯化钠：维持一定的渗透压琼脂：凝固剂，不易分解，一般不作为营养物质。其在96℃时融化成液体，冷却到45℃以下即重新凝固种类①按物理状态分：固体培养基、半固体培养基、液体培养基②按特殊用途分：基础培养基、加富培养基、选择培养基和鉴别培养基③按培养的微生物分：细菌培养基(pH呈中性偏碱，添加有机物如蛋白胨、酵母提取物，还要添加氯化钠以维持渗透压)、霉菌培养基(pH呈中性偏酸，添加无机物或添加蔗糖的豆芽汁)(2)灭菌操作项目灼烧灭菌高压蒸汽灭菌过滤灭菌适用材料或用具接种环、接种针或其他金属用具培养基、培养皿、试管等玻璃器具等尿素等加热会分解的物质灭菌条件及时间在酒精灯火焰上充分灼烧，直至烧红，冷却后备用①LB培养基：121℃(1kg/cm2压力)、15min②含葡萄糖的培养基：90℃以上(500g/cm2压力)、30min③玻璃器皿：高压蒸汽灭菌后放入G6玻璃砂漏斗过滤60～80℃烘箱中烘干2.大肠杆菌的培养和分离(1)大肠杆菌①特性：大肠杆菌是革兰氏阴性、兼性厌氧(代谢类型)的肠道杆菌，在肠道中一般对人无害，但若进入人的泌尿系统，就会对人体产生危害。②用途：是基因工程技术中被广泛采用的工具。(2)细菌的培养和分离①细菌的繁殖：以分裂的方式繁殖，分裂速度很快，约20min分裂一次。②培养的方法：需要将已有细菌的培养物转移到新的培养基中，一般用接种环(工具)转移带菌的培养物。③细菌分离的方法与特点分离方法特点划线分离法操作简单涂布分离法操作复杂，单菌落更易分开(3)大肠杆菌的培养和分离实验①实验内容：将大肠杆菌扩大培养和划线分离，即用LB液体培养基扩大培养大肠杆菌，培养后再在LB固体平面培养基上划线进行分离，随后培养基上便会形成一个个单独的菌落。②实验步骤培养基灭菌↓倒平板↓接种↓划线分离↓培养观察50mLLB液体培养基和50mLLB固体培养基及培养皿进行高压蒸汽灭菌将培养基分别倒至4个灭菌后的培养皿中，水平放置，使之形成平面在装有液体培养基的三角瓶中接种大肠杆菌，培养12h用接种环在接种有大肠杆菌的三角瓶中蘸菌液一次，在固体培养基的平板上连续划线，盖好培养皿培养皿倒置(盖在下面)，放在37℃恒温培养箱中培养12～24h后，可看到划线的末端出现不连续的单个菌落③大肠杆菌分离的用途：单菌落的分离是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。3.微生物两种常用的接种方法比较比较划线分离法涂布分离法工具接种环玻璃刮刀原理通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细菌细胞繁殖而来的肉眼可见的细胞群体，即菌落将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细菌细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落特点方法简单，但不适宜计数单菌落更易分开，但操作复杂些目的使培养基上形成由单个细菌细胞繁殖而来的子细胞群体——菌落(1)玻璃砂漏斗用后需用1mol/L的HCl浸泡，并抽滤去酸，再用蒸馏水洗至洗出液呈中性，干燥后保存(√)(2)科研人员在超净台上进行接种操作时，为了保证无菌环境，打开紫外灯和过滤风(×)(3)倒平板时，应将打开的培养皿盖放到一边，以免培养基溅到培养皿盖上(×)(4)用涂布分离法纯化大肠杆菌时，只要稀释度足够高，就能在培养基表面形成单个菌落(√)(5)划线分离法简单并且可以用来计数，涂布分离法使单菌落更易分开，但操作复杂些(×)(6)微生物的分离和培养实验结束后，将培养基倒入废料桶并用清水将器皿清洗干净(×)(7)下图中甲为划线分离法中最重要的环节，乙为操作的结果：①每一次划线后都...
