AFP启动子介导胸苷激酶表达载体的构建及其特异性表达【摘要】【目的】构建AFP启动子介导HSV-TK基因表达载体，并对其在肝癌细胞中特异性表达进行分析。【方法】采用PCR法扩增人AFP基因启动子。回收纯化后克隆入pBluescriptIIKDR-TK相同克隆位点，切取AFP-TK片段，然后通过酶联反应插入到pEGFP-C1中，构建成pEGFP-C1-AFP-TK。对获得的片段进行鉴定、细胞靶向和外源基因表达的鉴定。【结果】序列分析表明，该启动子含300bp核苷酸，与已报道的序列比较，100%相符。限制性酶切分析，重组质粒pEGFP-C1-AFP-TK已经克隆AFP启动子。RT-PCR及Westernblotting分析pEGFP-C1-AFP-TK转染后的HepG2细胞后，表明TK基因在mRNA水平上能有效的表达，裂解后的HepG2细胞膜蛋白中有相对分子质量约61～83ku大小的特异性条带。【结论】人肝细胞癌(HepG2)靶向性质粒pEGFP-C1-AFP-TK构建成功。【关键词】AFP启动子;HepG2细胞;靶向表达;单纯疱疹病毒-胸腺嘧啶激酶1Abstract：【Objective】Toconstructtheherpessimplexvirusthymidinekinasetype1(HSV-1-TK)expressionvectorwithalpha-fetoprotein(AFP)expressiongeneasstarter，andanalyzingitsspecificexpression.【Method】TheAFPpromoterwasamplifiedbymeansofPCR.ItwaspurifiedandclonedonthecloningsiteofpBluescriptIIKDR-TK.ThentheAFP-TK，fragmentwasobtainedandinsertedintopEGFP-C1withT4DNAligase.Theobtainedfragmentwasidentifiedforitscelltargetingandexogenousgenesexpression.HepG2genomeDNAwasextractedastemplatetoamplifytheAFPsequence(300bp).ItsPCRproductwasthenconjugatedwithpMD-18，thenamplifiedandextracted.ThepMD-18-AFPwasdigested，andthenthefragmentwasclonedintopBluescriptIIKDR-TK.ThentoproducethewholeexpressingfragmentofAFP-TKwhichwasinsertedintothepEGFP-C1.ThentheconstructionofpEGFP-C1-AFP-TKfinished.Thegeneproductwassentforsequencingevaluation.AndtheexpressionofpEGFP-C1-AFP-TKinHepG2cellsandECV304cellswasevaluated.AnditsmRNAexpressionwasalsoevaluated.【Result】Thesequenceanalysisprovedthatthepromotercontained300bpnucleicacidwhichwas100%consistencywithliteratures.TheresultofrestrictionendonucleaseanalysisdemonstratedthattherecombinedpEGFP-C1-AFP-TKwasclonedwithintheAFPasanAFPpromoter.TheresultsofRT-PCRandWesternblottingfromtheHepG2cellstransfectedwithpEGFP-C1-AFP-TKdemonstratedthatTKmRNAwasexpressedeffectively.ThelysisfromtheHepG2cellswasaspecificbandof61-83ku.ThepEGFP-C1-AFP-TKwastranscriptedinHepG2cellsandexpressedinHepG2mRNAeffectively.【Conclusion】TheplasmidofpEGFP-C1-AFP-TKspecificforHepG2cellswassuccessfullyconstructed.Keyword：alpha-fetoproteinpromoter;HepG2cells;targetingexpression;herpessimplexvirusthymidinekinasetype1[JSUNYat-senUniv(MedSci)，2009，30(5)：591-594]蛋白转移到硝酸纤维膜上。室温封闭2h后，然后在膜中加入1：1000稀释的山羊抗人TK-抗4℃孵育过夜，TBST(20mmol/LTris-HClpH7.4，140mmol/LNaCl，0.1%Tween-20)洗涤后加入溶有兔抗山羊二抗的封闭液，室温摇床孵育2h，TBST洗涤后经ECL化学发光试剂孵育，暗室内X线底片感光成像。随着分子生物学技术的不断进展，人们对肿瘤分子机制研究的不断深入，利用肿瘤与正常组织基因及调控区域的结构差异，从分子水平特异性杀伤肿瘤细胞的基因治疗成为肿瘤治疗中极具应用潜力的新策略[1-2]。组织特异性启动子由于其在不同组织细胞中的活性相差很大，因此可驱动目的基因在靶器官组织中的特异性表达，实现基因治疗的靶向性，避免了对其它器官的不良反应[3]。人甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)的胎肝特异表达由其启动子的组织特异性决定，绝大部分肝细胞癌组织具有恢复AFP表达的特性，因此，利用AFP基因启动子构建的载体系统具备肝癌细胞靶向性成为可能。本文利用肿瘤与正常组织中间的这种特异性差异原理，设计了肝肿瘤细胞特异性启动子-AFP启动子，构建含AFP启动...
