新疆白芸豆中凝集素的提取及纯化工艺VIP专享VIP免费

新疆白芸豆中凝集素的提取及纯化工艺凝集素（lectin）是一类至少有1个非催化结构域、能非共价地可逆结合专一性单糖或寡糖的非免疫源性、非酶本质的糖结合蛋白，目前在动物、植物、微生物和病毒中均有發现[1-3]。关于凝集素的免疫作用、抗营养作用（致毒作用）、使细胞表面成分再分布、修饰细胞膜酶的活力、阻断卵受精、对脂肪细胞具有类似胰岛素的活性等也逐渐被研究和证实[4-5]。目前对于凝集素的研究主要集中于植物凝集素，由于凝集素对于单糖或糖复合物特异性结合的能力，使其在如信号转导、免疫反应、植物防御等诸多信号过程中均具有重要作用。同时，凝集素具有细胞凝集、抗病毒、抗真菌及诱导细胞凋亡或自噬等多种能力，因此在生命科学、医学及农业方面均有较好的研究价值和应用前景。在植物凝集素研究中发现，豆科植物凝集素种类最丰富，有600多种，其中70多种已经被分离纯化，大多来自豆科植物的种子，在成熟种子中占蛋白质总含量的10%左右。另外，在其他组织，如叶、茎、果实、树皮、根中也分布着一些与种子凝集素高度同源的凝集素[7-9]，它们虽然与种子凝集素有类似的氨基酸序列和糖结合特异性，但仍然是由不同基因编码的。豆科植物凝集素一级氨基酸序列和三级结构相似性很高，但是糖专一性和四级结构却有很大的不同。因此，研究不同豆科类来源凝集素的结构，对于豆科类凝集素在生物学、农学和医学领域的应用具有重要的意义。白芸豆（whitekidneybean）属豆科（Leguminosae）蝶形花亚科（Papiliononideae）菜豆族菜豆属。由于其营养价值丰富（100g干豆中含碳水化合物37.6%～48.5%，蛋白质19.9%～20.0%，脂肪1.6%～2.1%，钙120mg，铁10mg），因此可作为一种高钾低钠食品，适合高血脂、心脏病、动脉硬化和忌盐者食用，而且食用后不会产生腹泻、乏力、厌食、体质量反弹等现象，完全符合世界卫生组织的减肥原则[13-16]。因此，自白芸豆从阿根廷、墨西哥引进并经人工栽培驯化后已经在全国各地广泛种植。然而，目前关于白芸豆中凝集素的研究却鲜有报道。因些，本研究以新疆白芸豆为研究对象，通过响应面分析法优化凝集素的提取工艺，并通过实际试验考察以验证响应面模型的正确性。利用二乙氨乙基（DEAE）A-50阴离子交换层析和SephadexG-75凝胶层析对凝集素的粗提取物进行纯化，通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析，确定目标凝集素的分子量，以期为后续研究其结构及生理功能打下基础。1材料与方法1.1材料与试剂主要材料：白芸豆，购自新疆石河子市好家乡超市。主要试剂：牛血清蛋白（分析纯），天津市致远化学试剂有限公司；磷酸二氢钠（分析纯）、磷酸氢二钠（分析纯），天津市福晨化学试剂厂；氯化钠（分析纯）、分析纯乙醇（95%），天津市永晟精细化工有限公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris，分析纯），北京拜尔迪生物科技有限公司；考马斯亮蓝（CoomassieBrilliantBlue）G-250（分析纯），Biotopped。1.2仪器与设备主要仪器与设备：PHS-3C型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；BINDER电热恒温鼓风干燥箱，北京航鹏普瑞技术开发中心；HeraeusMultifugeX3电动离心机，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；RHP-600高速粉碎机，浙江荣浩工贸有限公司；KQ-200VDE超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；UVmini-1240紫外分光光度计，岛津（中国）有限公司；JM-B*****电子天平，诸暨市超泽衡器设备有限公司。1.3试验方法1.3.1原料预处理将市场上购买的白芸豆去除杂质，准确称取30g，在4℃冰箱中用150mL蒸馏水浸泡24h，捞去杂质并沥干后，手工去皮，在35℃烘箱中干燥后经粉碎机粉碎，过80目筛得到白芸豆种子粉末。将经过上述处理的样品装入聚乙烯袋中，4℃冰箱中保藏备用。1.3.2蛋白质浓度的测定对蛋白质含量的测定采取的是考马斯亮蓝G-250法。参考王孝平等的方法，略有改动。1.3.3白芸豆凝集素活力检测参照李笑梅等的方法[18-19]，略有改动。利用采血管抽取新鲜鸡血10mL，抽取2mL至肝素钠抗凝管中。将新鲜血液倒入离心管中并于3000r/min离心3min，用移液枪去除上层血清，向沉淀中添加生理盐水以清洗血红细胞。轻轻颠倒摇匀洗涤，然后再次于3000r/min离心3min，去除上...