MRC-5体外培养细胞生长曲线测定-详细VIP免费

MRC-5体外培养细胞生长曲线测定一．实验目的认识细胞接种和传代培养中细胞生长增殖规律。二．实验原理在培养接种或每一次传代培养过程中，培养物都要经历相似的恢复和生长过程。细胞生长曲线反映的是培养细胞从接种到传代之前的生长状况，也是判定细胞活力的重要指标。一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的潜伏期，紧接着进入大量分裂的指数生长期。在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平台期，然后退化衰亡。为了准确描述整个过程中细胞数目的动态变化，典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期，斜率较大的指数生长期，呈平台状的平台期及退化衰亡4个部分。以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标绘制细胞的生长曲线坐标图。三．实验准备3.1实验人员用品工作服、帽子、口罩、手套、肥皂、医用手臂消毒桶、0.1%新洁尔灭消毒液；3.2消毒和灭菌用品电炉、高压蒸汽灭菌锅、铝盒、24孔细胞培养板、移液管、枪头、洗耳球、离心管（规格：1.5mL/5mL/10mL）；3.3药品和试剂DMEM细胞培养液（10%血清）、0.25%胰蛋白酶-0.53MmEDTA、PBS(-)；3.4细胞MRC-5人二倍体细胞；3.5设备与器材CO2培养箱、离心机、移液枪（规格：1000uL、200uL）、二级生物安全柜、血细胞计数板、显微镜、记号笔、废液瓶；四．实验步骤4.1细胞接种4.1.1选择生长良好的MRC-5人二倍体细胞，移液管移除原细胞培养液至废液瓶中；4.1.2DPBS润洗三次，每次5mL；4.1.3吸管吸取1mL胰蛋白酶溶液浸润培养层细胞，37℃恒温消化2～10min；4.1.4用含10%血清的DMEM培养液4mL终止消化；4.1.5将终止消化后的细胞悬液用移液管转移至离心管中，1000r/min离心8min，弃上清；4.1.6吸管吸取2mLDMEM细胞培养液悬浮细胞；4.1.7对细胞悬浮液进行细胞计数；3444.1.8调整悬浮液的细胞浓度分别为5×10个/mL(A)、2×10个/mL(B)、5×10个4/mL(C)3种不同的细胞浓度（细胞理论数：1.575×10个）；4.2细胞培养3444.2.1依次将浓度为5×10个/mL(A)、2×10个/mL(B)、5×10个/mL(C)的细胞悬液分装于3个有盖的24孔细胞培养板，分别按每孔接种1mL，每种浓度各接21孔，进行细胞的悬浮培养；4.3细胞换液细胞接种培养后，分别按照每间隔3d和5d换液一次。4.3.1吸管吸取细胞悬液并将其移入1.5mL离心管中，1000r/min离心8min；4.3.2离心后，用移液管将上清液移至废液瓶；4.3.3吸管吸取1mL新鲜的DMEM细胞培养液悬浮细胞，吹打混匀；4.3.4将离心管中的细胞悬液移入相应细胞培养板的培养孔中继续培养；4.4细胞生长计数每隔24小时计数一次，每次每个浓度各取3孔，细胞计数后取平均数，如此操作至第7d结束。4.4.1吸管吸取细胞悬液于已标记好的离心管中吹打混匀；4.4.2微量加样器取混匀后的细胞悬液100uL于1.5mL离心管中，加入100uL台盼兰混合均匀，进行细胞染色2min；4.4.3将染色后的细胞悬液加于已盖好盖玻片的血细胞计数板的计数室；4.4.4显微观察：100倍的倒置显微镜下观察记录计数板4角大方格中的细胞数，细胞压边线时，只记压上线和左边线者，将计数结果代入下式进行细胞密度计算。4细胞密度：（个/mL）=(4个大方格细胞总数/4)×2×104.5生长曲线绘制以培养时间（d）为横坐标，以细胞密度（个/mL）为纵坐标，绘制细胞生长曲线并按下面的公式计算细胞倍增时间。Td=lg2lgNt−lgN0Td：细胞倍增时间；t：培养时间；Nt：Td时的细胞数；N0:接种后细胞数。注意事项：1．在制备细胞悬液时一定要匀速吹打，混合均匀，防止产生气泡；2．计数前细胞悬液制备（若细胞贴壁需进行）计数前，吸除培养孔内的培养液，PBS(-)洗3次，加入200uL细胞消化液，于37℃、5%CO2培养箱内消化3～10minmin。用含10%血清的DMEM培养液800uL终止消化，轻轻吹打均匀，制成单细胞悬液。预实验：1、细胞贴壁性验证制备细胞悬液（培养液为DMEM，细胞浓度为：5×10个/mL）,吸取5mL细胞悬液于消毒后的T25细胞培养瓶，置于37℃、5%CO2培养箱中培养5天，每隔半天观察细胞是否贴壁。2、细胞浓度调整：根据起始浓度进行浓度由大到小的浓度依次稀释，稀释完成一定要混匀后再分装。3、细胞生长情况预实验：41mL细胞悬液离心管另一种细胞生长曲线测定法：MTT法1．制备1mL细胞悬液。空白对...