基因表达检测的最终技术目标是能确定所关注的任何组织、细胞的RNA的绝对表达量。可以先从样本中抽提RNA，再标记RNA，然后将这些标记物作探针与芯片杂交，就可得出原始样本中不同RNA的量。然而用于杂交的某个特定基因的RNA的量与在一个相应杂交反应中的信号强度之间的关系十分复杂，它取决于多种因素，包括标记方法、杂交条件、目的基因的特征和序列。所以芯片的方法最好用于检验两个或多个样本中的某种RNA的相对表达量。样本之间某个基因表达的差异性（包括表达的时间、空间特性及受干扰时的改变）是基因表达最重要的，而了解RNA的绝对表达丰度只为进一步的应用或多或少地起一些作用。基因表达的检测有几种方法。经典的方法（仍然重要）是根据在细胞或生物体中所观察到的生物化学或表型的变化来决定某一特定基因是否表达。随着大分子分离技术的进步使得特异的基因产物或蛋白分子的识别和分离成为可能。随着重组DNA技术的运用，现在有可能检测．分析任何基因的转录产物。目前有好几种方法广泛应用于于研究特定RNA分子。这些方法包括原位杂交．NORTHERN凝胶分析．打点或印迹打点．S－1核酸酶分析和RNA酶保护研究。这里描述RT-PCR从RNA水平上检查基因表达的应用。8f3f-|2L)K)b7]-~-|RT-PCR检测基因表达的问题讨论关于RT-PCR技术方法的描述参见PCR技术应用进展，在此主要讨论它在应用中的问题。理论上1μL细胞质总RNA对稀有mRNA扩增是足够了（每个细胞有1个或几个拷贝）。1μL差不多相当于50－100，000个典型哺乳动物细胞的细胞质中所含RNA的数量，靶分子的数量通常大于50，000，因此扩增是很容易的。该方法所能检测的最低靶分子的数量可能与通常的DNAPCR相同；例如它能检测出单个RNA分子。当已知量的转录RNA（用T7RNA聚合酶体外合成）经一系列稀释，实验结果表明通过PCR的方法可检测出10个分子或低于10个分子，这是反映其灵敏度的一个实例。用此技术现已从不到1个philadelphia染色体阳性细胞株K562中检测到了白血病特异的MRNA的转录子。因此没必要分离polyA+RNA，RNA/PCR法有足够的灵敏度来满足绝大多数实验条件的需要。7H+F&_*S6W(a8p:[,@-d,{将PCR缓冲液同时用于反转录酶反应和PCR反应，可简化实验步骤。我们发现整个反应过程皆用PCR缓冲液的结果相当于或优于先用反转录缓冲液合成CDNA，然后PCR缓冲液进行PCR扩增循环。当然，值得注意的是PCR缓冲液并不最适合第一条DNA链的合成。我们对不同的缓冲液用于大片段DNA合成是否成功还没有进行过严格的研究。反转录酶的选择似乎对实验方法成功与否并不十分重要。BRL和BOEHRINGERMANNHEIM的MULV反转录酶进行全面的研究，但没有理由认为来源可靠的反转录酶不能适用于该方法。在研究中，我们仅使用了PERKINELMER/CETUS公司生产的TAQ聚合酶。cDNA第一条链的合成可用不规则六聚体、寡聚(dT)或PCR下游引物来启动反应。如果用寡聚(dT)，一般每次反应加0.1μL就够了。如果用下游寡核苷酸作为第一条链的起始引物，10-50pmol最为理想。反转录反应以后，加入适量的上游和下游引物进行PCR反应与用不规则六聚体方法一样。三种启动方法中无论用那一种最后得到的扩增产物都同样理想。而加入不规则六聚体似乎更容易得到前后一致的结果，且靶序列的合成量通常最多(E.S.K.)加入不规则六聚体方法一样。三种启动方法中无论用那一种最后得到的扩增产物都同样理想。而加入不规则六聚体似站更容易得到事一致的结果，且靶序列的合成量通常最多(E.S.K.未发表)。第一条链合成完毕，不必加碱或RNA酶以除去RNA模板95℃热处理使反转录酶失活，同时也使RNA-DNA杂合子变性。不必加碱或RNA酶以除去RNA模板。95℃热处理使反转录酶失活，同时也使RNA-DNA杂合子变性。残留的RNA模板似乎对PCR反应无干扰。5d'b"L&Q'\y寻找使PCR反应产生良好扩增结果的最低浓度的寡核苷酸引物是十分重要的。我们发现过量的引物通常会产生许多妨碍随后分析的额外扩增产物。浓度为5pmol的引物可得到非常清晰及有效的扩增产物。当然，最好是找到你要扩增的每个序列的最佳引物量。没有必要用全部的cDNA反应产物进行PCR扩增。可取等分量cDNA样品用几组不同的引物作PCR分析;例如:一份cDNA反应物可用于研...
