蛋白质浓度测定方法 生物教学课件VIP免费

蛋白质浓度测定方法第一页，共三十五页。四种古老的经典方法：定氮法双缩尿法〔Biuret法〕Folin－酚试剂法〔Lowry法〕紫外吸收法新的测定法：考马斯亮蓝法〔Bradford法〕更新的测定方法：BCA法第二页，共三十五页。分光光度计的使用第三页，共三十五页。原理光线的本质是电磁波的一种，有不同的波长。肉眼可见的彩色光称为可见光，波长范围在400～750nm：小于400nm的光线称为紫外光；大于750nm的光线称为红外光。当光线通过透明溶液介质时，其辐射的波长有一局部被吸收，一局部透过、因此光线射出溶液之后，局部光波减少，这种光波的吸收和透过可用于某些物质的定性定量分析。第四页，共三十五页。依据Lambert-Beer〔朗伯－比尔〕定律，一束单色光通过溶液后，光波被吸收一局部，其吸收多少与溶液中溶质的浓度和溶液厚度成正比。当入射光、吸收系数K和溶液的光径长度L不变时，吸光度A与溶液的浓度C成正比。具体测量时，第五页，共三十五页。补充知识第六页，共三十五页。７２１型可见分光光度计第七页，共三十五页。第八页，共三十五页。紫外分光光度计第九页，共三十五页。微量凯氏〔Kjeldahl〕定氮法第十页，共三十五页。原理样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨〔消化〕，氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。第十一页，共三十五页。以甘氨酸为例，其反响式如下：NH2CH2COOH+3H2SO4==2CO2+3SO2+4H2O+NH3(1)2NH3+H2SO4==(NH4)2SO4(2)(NH4)2SO4+2NaOH==2H2O+Na2SO4+2NH3(3)反响〔1〕、(2)在凯氏瓶内完成，反响〔3〕在凯氏蒸馏装置中进行。为了加速消化，可以参加CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定那么用强酸。第十二页，共三十五页。器材1.100ml凯氏烧瓶2.改进型凯氏定氮仪3.50ml容量瓶4.分析天平〔电子天平〕5.烘箱6.电炉7.酒精灯8.小玻璃珠9.滴定管10.洗瓶11.锥形瓶12.铁架台第十三页，共三十五页。试剂1.消化液：30%H2O2∶浓H2SO4H2O=321∶∶∶2.30%NaOH溶液3.2%H3BO3溶液4.混合催化剂〔粉末K2SO4-CuSO4混合物〕K2SO4与CuSO4以31∶比例充分研细混匀。5.0.01mol/L标准盐酸溶液6.混合指示剂〔田氏指氏剂〕取0.1%甲烯蓝-无水乙醇溶液50ml、0.1%甲基红-无水乙醇溶液200ml，混合，贮于棕色瓶中备用。该指示剂酸性时为紫红色，碱性时为绿色，变色范围很窄〔pH5.2～5.6〕且很灵敏。7.蒸馏水第十四页，共三十五页。假设测定的样品含氮局部只是蛋白质，那么样品中蛋白质含量〔%〕=总氮量×6.25假设样品中除有蛋白质外，尚含有其他含氮物质，那么需向样品中参加三氯乙酸，然后测定未加三氯乙酸的样品及参加三氯乙酸后样品上清液中的含氮量，得出非蛋白氮及总氮量，从而计算出蛋白氮，再进一步算出蛋白质含量。蛋白氮=总氮-非蛋白氮蛋白质含量〔g%〕=蛋白氮×6.25第十五页，共三十五页。双缩脲法N端C端第十六页，共三十五页。双缩脲加热＋NH322H－1800双缩脲22222第十七页，共三十五页。双缩脲反响:碱性环境H2OO=CC=OHNNHR-CHCH-RO=CCuC=OHNNHR-CHCH-RH2O紫色络合物第十八页，共三十五页。原理双缩脲法是利用蛋白质的双缩脲反响而测定蛋白质含量的方法。因蛋白质含有两个以上的肽键，所以有双缩脲反响。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。在一定的实验条件下，未知样品溶液与标准蛋白质溶液同时反响，并于540~560nm测定，即可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。第十九页，共三十五页。试剂一试剂1．标准酪蛋白溶液〔5mg/ml〕用0.05mol/LNaOH溶液配制：5g酪蛋白加0.05mol/LNaOH溶液至1000ml。2．双缩脲试剂溶解1.5g硫酸铜〔CuSO4·5H2O〕和6.0g酒石酸钾钠〔NaKC4H4O6·4H2O〕于500ml蒸馏水中。在搅拌下参加10%NaOH溶液300ml，用蒸馏水稀释到1升，贮存在内壁涂有石蜡的瓶中，可长期保存。3．未知蛋白质溶液γ–球蛋白溶液。第二十页，共三十五页。Folin－酚试剂法〔Lowry法〕蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚试剂...