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RT-PCR生物化学与分子生物学研究所一、定义二、逆转录逆转录(reversetranscription)以RNA为模板，合成与其互补的DNA的过程。逆转录酶(依赖RNA的DNA聚合酶)1.RNA指导的DNA聚合酶活性2.RNA水解酶活性3.DNA指导的DNA聚合酶活性过程RNAÄ£°åµ¥Á´DNAË«Á´DNADNA-RNAÔÓ»¯Ë«Á´试管内逆转录反应FirststrandcDNAsynthesis反应体系的基本成分模板:组织或培养细胞RNA。引物:oligodT,randomprimer等。逆转录酶：AMV:禽类成髓细胞性白血病病毒M-MLV：莫洛尼鼠白血病病毒RNA酶抑制剂底物：等浓度的四种dNTP反应环境:缓冲液（RTbuffer）•随机引物法是三种方法中特异性最低的引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。为了获得最长的cDNA，需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA的比例。随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20μl反应体系。•Oligo(dT)比随机引物特异性高它同大多数真核细胞mRNA3‘端的poly(A)尾杂交。因为poly(A)+RNA大概占总RNA的1%到2％，所以与使用随机引物相比，cDNA的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，oligo(dT)一般不需要对RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化。建议每20μl反应体系使用0.5μgoligo(dT)。oligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR。•基因特异性引物（GSP）对于逆转录步骤是特异性最好的引物。FirststrandcDNAsynthesis反应的条件1.加入模板，引物，dNTP，DEPC-H2O（冰上）2.65℃，5min（变性）；冰上放置3.加入10XRTbuffer，RNasin，RT，DEPC-H2O4.42/50(℃℃根据所购试剂盒酶的性质），60min（延伸）5.85℃处理5m，立即放置到冰上（酶失活）6.加入1μl的RNaseH，37℃处理20m（降解RNA）7.取出2-5μl进行PCR试验/分装，-20℃保存按试剂盒说明进行三、聚合酶链式反应--PCR一种将微量的目的DNA片段在体外快速、大量扩增的技术。以目的DNA（待扩增DNA）分子为模板，以一对分别与模板3’末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成2条新DNA链的合成。不断重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。PCR试管内模拟细胞内DNA半保留复制PCR反应体系的基本成分模板DNA:基因组DNA、cDNA等特异引物:与模板DNA特异互补的单链寡聚dNTP片段，一般18-30,上下游引物0.2-0.5μmol/L，设计原则？DNA聚合酶:具耐热性、如Taq酶0.5-5U/100μl底物:等浓度的四种核苷酸（dNTP）20-200μmol/L反应环境:含有Mg2＋的Tris-Cl缓冲液。PCR反应的条件•预变性：94℃，2-10min•变性：94℃,30s,模板DNA变性成为单链•退火：Tm-5℃,30s，引物与模板DNA结合•延伸：72℃，DNA聚合酶催化DNA合成时间与待扩增片段长度有关，<1Kb,1min；>1Kb,延长时间重复25-30cycle.•最终延伸：72℃，10min。RT-PCR应用•获得目的基因（编码蛋白）•RNA定性及半定量分析Marker组1组2内参基因目的基因组1：control组2：药物处理后实验内容RT-PCR扩增小鼠肝组织β-actin基因•RNA质量的高低影响实验的成败。•RNA完整性：RNA酶（RNase）是导致RNA降解最主要的物质。此酶广泛存在，且非常稳定，在一些极端的条件下只可暂时失活，但限制因素去除后又迅速恢复活性。常规高温高压灭菌方法和蛋白抑制剂不能使所有的RNase完全失活。因此，RNA提取时最需要注意的是RNA酶的失活处理。•防止DNA/蛋白质的污染一、RNA的提取处理方法•RNase广泛存在于人的皮肤上，因此制备RNA时必须戴手套。•RNase的又一污染源是移液器。根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用以DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，可基本达到要求。•玻璃和金属物品250℃烘烤3小时以上。•枪头、Ep管等塑料制品RNase-free的枪头与Ep管（贵）处理：DEPC-H2O浸泡•在玻璃容器中注入去离子水，加入DEPC使其终浓度为0.05%--0.1%（DEPC-H2O），37℃过夜。（DEPC二乙基焦碳酸酯为活性很强的剧毒物，须在通风橱中小心使用）•将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC-H2O，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中，在通风柜中37℃或室温下处理过夜。•将装有DEPC-H2O处理过的塑料制品的容器以铝箔封口，高温高压蒸汽灭...