实验五、叶绿体的分离与观察VIP免费

实验六叶绿体的分离与观察•叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的。•实验目的1.通过植物细胞叶绿体的分离,了解细胞器分离的一般原理和方法。2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光,并了解荧光显微镜的使用方法。•实验原理•组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。•一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。LowspeedHighspeedDifferentialcentrifugation•试剂与器械•1.器材:普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。烧杯2个,250ml量筒1个,滴管20支,10ml刻度离心管20支,试管架5个，纱布若干，载片和盖片各4片。•2.试剂:0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙(acridineorange)。三.实验步骤（一）叶绿体的分离与观察1.选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称30g于150ml0.35mol/LNaCl溶液中，装入组织捣碎机。2.利用组织捣碎机低速(5000r/min)匀桨3-5min。3.将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。4.取滤液4ml在1000r/min下离心2min，弃去沉淀。5.将上清液在3000r/min下离心5min。弃去上清液，沉淀即是叶绿体(混有部分细胞核)。6.将沉淀用0.35mol/LNaCl溶液悬浮。7.取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在显微镜下观察。•（二）菠菜叶手切片观察新鲜菠菜叶↓刀片切出一斜面置于载玻片上↓滴加1~2d氯化钠溶液↓盖上盖片显微镜下观察•实验结果（一）叶绿体的分离和观察1.普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。2.以Olympus荧光显微镜为例，在先用B(bule)激发滤片、B双色镜和O530(orange)阴断滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光。3.加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧光。•（二）菠菜叶手切片观察1.在普通光镜下可以看到三种细胞(1)表皮细胞:为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞;(2)保卫细胞:为构成气孔的成对存在的肾形细胞；(3)叶肉细胞:为排列成栅状的长形和椭圆形细胞。叶绿体呈绿色橄榄形，在高倍镜下还可以看到绿色的基粒。•2.在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光，但其荧光强度要比游离叶绿体弱,气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内的叶绿体数量要比叶肉细胞少。3.用吖啶橙染色后，叶绿体则发出桔红色荧光，细胞核可发出绿色荧光,气孔仍为绿色。•3.用吖啶橙染色后，叶绿体则发出桔红色荧光，细胞核可发出绿色荧光,气孔仍为绿色。•作业1.根据荧光观察结果，绘制菠菜叶气孔的结构模式图。•思考题：•1.叶绿体分离的实验原理是什么？在分离叶绿体时应注意些什么问题？五.实验结果1.普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。2.用目微尺和台微尺测量一下叶绿体的长轴和短轴，分别测量5-10个叶绿体，求其平均值。六.思考题1.分别计算不同物镜放大倍数下测微尺的单位。2.鸭红细胞直径为多少微米.