神经细胞培养第一节：细胞培养的基本知识1定义：组织培养(Tissueculture)：细胞培养(cellculture)：器官培养(organculture)：统称为体外培养（Invitro)2组织或细胞培养的优点：1）：研究对象是活细胞2）：研究条件可以人为的控制3）：研究的样本可以达到比较均一性4）：研究的内容便于观察、检测和记录5）：研究的费用相对比较经济6）：可作为一些遗传物质的运载细胞7)：干细胞的广泛应用前景3组织或细胞培养的不足：1）与体内条件存在差异；2）细胞培养存在一定的不稳定性培养细胞学的研究内容1培养细胞学在病毒学中的应用2细胞生物学的基础研究:细胞培养使细胞生物学迅速发展3细胞工程学的研究手段，利用细胞融合及杂交技术，进行细胞工程的研究与开发。4干细胞的培养及应用5淋巴细胞培养技术的应用6遗传性疾病的产前检查7细胞作为毒性实验及生物安全性实验的工具8细胞培养在现代生物技术中应用很广，如基因分离，基因测序与表达，基因转移与重组，癌基因的研究等。4培养细胞的特性1）培养细胞生长方式：a贴附生长型细胞（大多数）b悬浮生长型细胞（少数）2）培养细胞生长特点：贴附；接触抑制；密度依赖性5培养细胞生长的条件1）细胞的营养需要：a基本营养物质：氨基酸、维生素、碳水化合物及一些无机离子；b营养因子等物质2）细胞的生存环境：a温度：哺乳动物和人类为35~37℃；鸟类为38.5℃b气相及PH值：O2及CO2的值：CO2=5%；PH=7.2~7.4c渗透压：260~320mmol/L3)无污染及无毒：体外培养的细胞必须生长于无污染及无毒的环境！！无毒：与细胞直接接触者—培养器皿、底物、培养基，蒸馏水等；间接接触者—配制培养基的器皿、瓶盖、瓶塞等无污染：微生物及交叉污染，（霉菌污染常见）6常用的培养用液及培养基培养用液：水平衡盐溶液（ＢＳＳ）（见表）作用：消化液１胰蛋白酶液（０．２５%）２二乙烯四乙酸二钠（ＥＤＴＡ）３胶原酶：甘氨酸羟脯氨酸敏感培养基：1天然培养基（血清，血浆，组织浸出液，水解乳蛋白）2合成培养基（ＭＥＭＤＭＥＭＨＡＭ`SF12ＲＰＭＩ（１６４０）１９９Ｌ－１５）等常用的平衡盐溶液（g/L）Ringer(1985)PBSEargle(1948)Hanks(1949Dulbecco(1954)D-HanksNaClKCl9．000．428．000．206．800．408．000．408．000．208．000．40CaCl2MgCl.6H2OMgSO4.7H2O0．250．200．200．140．201．100．10Na2HPO4.H2O1．560．060．06Na2HPO4.2H2OKH2PO40．201．140．062．420．200．06NaHCO3葡萄糖酚红3．201．000．020．351．000．020．020．350．02细胞计数法：原则：取0.1ml细胞悬液加Hanks液0.9ml，混匀后滴于血细胞计数板上，在低倍显微镜下计数四角大方格内细胞。计数过程中对于大方格边缘压线按照数上不数下，数左不数右的原则。细胞浓度=4个大方格内细胞数4×104×稀释倍数=细胞数/ml细胞活性的检查台盼蓝染色：0.2ml细胞悬液加0.4ml台盼蓝溶液混合，滴少许于载波片上，低倍镜计数200细胞，算比率，正常不着色，死细胞为兰色细胞活力（%）=（细胞总数-着色细胞数）/总细胞数×100%第二节：神经细胞体外培养的基本概念和方案神经细胞培养的类型1原代培养原代培养（primaryculture)：指从活体获得细胞、组织或器官在体外条件下进行的第一次培养传代培养(subculture)：当细胞持续生长到达一定密度之后，就应当将细胞分成两部分（或更多）至新的培养器皿并补充新的培养液为传代培养。2细胞系培养一神经元的原代培养(Primaryculture)一、组织来源：1）种属：大鼠小鼠家鸡瓜蟾海兔蜗牛水蛭等2）年龄：一般为胚胎或新生动物组织神经胶质细胞：生后早期大部分神经元：胚胎末期颗粒细胞：生后两周以内主要根据轴突和树突广泛分枝发育之前培养二、常用试剂1）培养液ADMEM：BF12培养液CDMEM/F12培养液D无血清培养液加神经营养因子ENeurobasal培养液2）D-Hank`液（其中可加入牛血清白蛋白3g/L）（HBSS）3)聚L-赖氨酸：处理培养皿（瓶）（10mg/L）5-10min4)神经营养因子：睫状神经营养因子（ciliaryneurotrophicfactor,CNTF):支持交感神经、副交感神经和感觉神经的生长与存活；脑源性神经营养因子（brainderivedneurotrophicfactor,BDNF):支持外周和中枢特殊细胞群...
