第三章 提取和分离VIP免费

第三章第三章DNADNA的提取与纯化的提取与纯化基因工程需要三种不同的基因工程需要三种不同的DNA:DNA:总总DNADNA质粒质粒DNADNA噬菌体噬菌体DNADNA学习内容：学习内容：制备细胞总制备细胞总DNADNA–培养、搜集细菌细胞培养、搜集细菌细胞–制备细胞提取物制备细胞提取物–DNADNA纯化、浓缩纯化、浓缩–从其他生物中提取总从其他生物中提取总DNADNA质粒质粒DNADNA提取提取–根据分子大小分离根据分子大小分离–根据结构分离根据结构分离–质粒扩增质粒扩增提取噬菌体提取噬菌体DNADNA–噬菌体的培养噬菌体的培养–制备非溶源性噬菌体制备非溶源性噬菌体–收集噬菌体收集噬菌体–从从λλ噬菌体中纯化噬菌体中纯化DNADNA–纯化纯化M13DNAM13DNAFigure3.1ThebasicstepsinpreparationoftotalcellDNAfromacultureofbacteriaBasicSteps1.1.制备总制备总DNADNA基本步骤：1)收集细菌细胞2)打碎细胞，释放内容物3)去掉DNA以外的成分4)DNA溶液的浓缩1.11.1培养、搜集细菌细胞培养、搜集细菌细胞两种类型的细菌培养基的成分：两种类型的细菌培养基的成分：M9M9培养基：培养基：NaNa22HPOHPO44(6.0)KH(6.0)KH22POPO44(3.0)NaCl(0.5)NH(3.0)NaCl(0.5)NH44CCl(1.0)MgSOl(1.0)MgSO44(0.5)Glucose(2.0)CaCl(0.5)Glucose(2.0)CaCl22(0.01(0.015)5)LBLB培养基：培养基：Yeastextract(5)NaCl(10)Yeastextract(5)NaCl(10)1.11.1培养、收集细菌细胞培养、收集细菌细胞37°C，150-250rpm达到最大浓度2-3×109cell/ml,600nm下的OD值，1OD相当于0.8×109cell/mlFigure3.2EstimationofbacterialcellnumberbymeasurementofopticaldensityFigure3.3Harvestingbacteriabycentrifugation1.21.2制备细胞提取物制备细胞提取物利用溶菌酶、利用溶菌酶、EDTAEDTA或两者结合。或两者结合。–溶菌酶是存在于蛋清或眼泪、唾液等分溶菌酶是存在于蛋清或眼泪、唾液等分泌物中，消化多聚物。泌物中，消化多聚物。–EDTAEDTA络合保持细胞结构完整的镁离子，络合保持细胞结构完整的镁离子，也可以抑制细胞中降解也可以抑制细胞中降解DNADNA酶的活性。酶的活性。–一般溶菌酶或一般溶菌酶或EDTAEDTA足以破坏细菌细胞，足以破坏细菌细胞，在提取液中同时还加入在提取液中同时还加入SDSSDS。。Figure3.4Preparationofacellextract.PreparationofacellextractPreparationofacellextractFigure3.5Removalofproteincontaminantsbyphenolextraction.◆◆PurificationofDNAfromacellextractPurificationofDNAfromacellextract1.1.制备细胞总制备细胞总DNADNA1.4DNA1.4DNA的浓缩与浓度测定的浓缩与浓度测定最常用的方法是乙醇沉淀（同时含有最常用的方法是乙醇沉淀（同时含有NaNa离子）。离子）。DNADNA沉淀可用玻璃棒挑出，或沉淀可用玻璃棒挑出，或者离心沉淀。者离心沉淀。260nm260nm下测定吸光度，下测定吸光度，1OD1OD相当于相当于5050μμgg双链双链DNA/mlDNA/ml。。AA260/A/A280=1.8=1.8，，<1.8<1.8表表示含有酚或蛋白质示含有酚或蛋白质,>2,>2说明有说明有RNARNAFigure3.6CollectingDNAbyethanolprecipitation.◆◆ConcentrationofDNAsamplesConcentrationofDNAsamplesFigure3.7TheCTABmethodforpurificationofplantDNA◆◆PlantDNA(CTABPlantDNA(CTAB法法))十六烷基三甲基溴化铵Figure3.8Theuseofananion-exchangechromatographyresininDNApurification.阴离子交换层析法阴离子交换层析法22质粒质粒DNADNA提取提取质粒质粒DNADNA的大小（的大小（8%8%）。）。DNADNA的构造的构造◇Alkalinedenaturation◇Ethidiumbromide（溴化二氨乙苯啡啶）-caesiumchloride（氯化铯）densitygradientcentrifugation22质粒质粒DNADNA提取提取2.12.1根据分子大小提取质粒根据分子大小提取质粒DNADNAsphaeroplastssphaeroplasts裂解细胞可以破坏部分细胞裂解细胞可以破坏部分细胞壁，而保持细胞膜的完整。壁，而保持细胞膜的完整。问题：问题：–裂解液中不可避免的包含一些染色体裂解液中不可避免的包含一些染色体DNDNAA–质粒分子非常大时，将与染色体质粒分子非常大时，将与染色体DNADNA共沉淀共沉淀Figure3.9Preparationofaclearedlysate...