碱性磷酸酶电泳(14年)VIP免费

SodiumDodecylSulfatePolyAcrylamideGelElectrophoresisSDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质（碱性磷酸酶纯度的鉴定）厦门大学生命科学学院SDS-PAGE的应用•1.Determiningsamplepurity——蛋白质纯度分析；•2.Establishingproteinsize——蛋白质分子量的测定，根据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子量；•3.Quantifyingproteins——蛋白质定量分析；•5.Proteinidentification——蛋白的鉴定；•6.Blottingapplications——免疫印迹的第一步；•7.identifyingpost-translationalmodificationofproteins——蛋白质修饰的鉴定…厦门大学生命科学学院purityamountPTM:ubiquitinationPTM:phosphorylation厦门大学生命科学学院实验目的1.掌握电泳技术的基本原理。2.掌握SDS-PAGE检测蛋白质分子的原理和技术。厦门大学生命科学学院1.电泳技术的基本原理Electrophoresis,alsocalledcataphoresis,isthemotionofdispersedparticlesrelativetoafluidundertheinfluenceofaspatiallyuniformelectricfield电泳：带电粒子在电场中的定向移动。影响泳动率u的因素内因：1.净电荷2.质点大小3.质点形状外因：1.V(U/L)2.缓冲液的pH(pH恒定)3.离子强度[I]最适:0.02-0.24.电渗：液体对固体支持物的相对移动厦门大学生命科学学院2.SDS-PAGE电泳原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(Acr)和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。推力：电荷（E）吸引；阻力：凝胶（PAG）阻碍物质运动聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同将蛋白质分离成若干条区带。SDS（十二烷基硫酸钠）与蛋白质结合,掩盖各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质-SDS复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只与分子大小相关。厦门大学生命科学学院厦门大学生命科学学院电泳过程示意图A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。2.SDS-PAGE电泳原理Cl-glycinesample厦门大学生命科学学院2.1.蛋白样品浓缩效应在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(runningbuffer：Tris-Gly，pH8.3)、浓缩胶缓冲液(stackinggelbuffer：Tris-HCl，pH6.8)、分离胶缓冲液(seperatinggelbuffer：Tris-HCl，pH8.8)。浓缩胶：Cl-（墙）>Pr->Gly(电中性-消失）由于Cl-很快超过蛋白离子，因此在其后面形成一个电导较低、电位梯度较陡的区域，该区电位梯度最高，这是在电泳过程中形成的电位梯度的不连续性，导致蛋白质和Gly-离子加快移动，结果使蛋白质在进入分离胶之前，快、慢离子之间浓缩成一薄层，有利于提高电泳的分辨率。厦门大学生命科学学院2.2.分子筛效应蛋白质离子进入分离胶后，其pH升高，使Gly解离成负离子的效应增加；同时因凝胶的浓度升高，蛋白质的泳动受到影响，迁移率急剧下降。分离胶：Cl->Gly->Pr-高电压梯度不复存在，蛋白质便在一个较均一的pH和电压梯度环境中，按其分子的大小移动。厦门大学生命科学学院2.3凝胶浓度的选择厦门大学生命科学学院3.样品处理1）上样缓冲液（样品缓冲液）：SDS：使蛋白变性，带上均一负电荷β-mercaptoethonol：还原剂，破坏二硫键，打破蛋白高级结构sucrose（glycerol）：帮助将样品沉入上样孔内电泳指示染料：溴酚蓝（bromophenoblue）2）煮沸：促进还原剂破坏二硫键，促进SDS和蛋白结合厦门大学生命科学学院4.电泳完毕后的检测1）考马斯亮蓝染色（R250）2）银染3）westernblot4）质谱分析厦门大学生命科学学院试剂和器材1.试剂1.1样品处理相关试剂样品缓冲液/上样缓冲液(2*SDS样品缓冲液)1.2SDS-PAGE电泳相关试剂分离胶缓冲液(3.0MpH8.9Tris-HCl缓冲液)浓缩胶缓冲液(0.5MpH6.7Tris-HCl缓冲液)凝胶贮液(30%Acr－0.8%Bis)10%过硫酸铵(APS)10%TEMEDTris-Glycine电极缓冲液(pH8.3)1.3考马斯亮蓝染色系统染色液，脱色液2.器材微量移液器，EP管垂直板电泳槽，直流稳压电源，微量进样器，玻璃板厦门大学生命科学学院厦门大学生命科学学院...