RNA的变性电泳原理VIP免费

RNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0%--1.4%的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下，RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总RNA样品完整性时，配制普通的1%琼脂糖凝胶即可。基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是，因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感，因此必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解；另外，因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。RNA非变性琼脂糖凝胶检测实验材料、器具及药品蘑菇的总RNA溶液。电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，0.5μg/ml溴化乙锭（EB）10X载样缓冲液。实验步骤（1）用1×TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。（2）在超净工作台上，用移液器吸取总RNA样品4ul于封口膜上。在实验台上再加入5ul1×TAE电泳缓冲液及1ul的10X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。（3）打开电源开关，调节电压至100V，使RNA由负极向正极电泳，约30min后将凝胶放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察RNA电泳结果。非变性电泳：上样量超过3ug，电压超过6V/cm，电泳缓冲液时间太长，均可能导致28S和18S条带分不开。使用2ug上样量，电压小于6V/cm，使用新鲜的电泳缓冲液并且频繁混匀两极的缓冲液，是获得好的电泳结果的前提。(以DNA标准为参照，28S和18S分别位于2.0kb和0.9kb左右。)变性电泳条带变淡：EB与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些。另外的可能是甲醛的质量不高。RNA的变性琼脂糖凝胶检测试剂：（1）MOPS缓冲液（10*）:0.4mol/L吗啉代丙烷磺酸（MOPS）(PH7.0)，0.1mol/LNaAc,10mol/LEDTA。（2）上样染料：50%甘油，1mmol/LEDTA,0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝。（3）甲醛。（4）去离子甲酰胺。电泳槽清洗：去污剂洗干净（一般浸泡过夜）——水冲洗——乙醇干燥——3%H2O2灌满——室温放置10分钟——0.1%DEPC水冲洗。操作：（1）将制胶用具用70%乙醇冲冼一遍，晾干备用。（2）配制琼脂糖凝胶。①称取0.5g琼脂糖，置干净的100ml锥形瓶中，加入40ml蒸馏水，微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀。②待胶凉至60--70℃，依次向其中加入9ml甲醛、5ml10XMOPS缓冲液和0.5ul溴化乙锭，混合均匀。③灌制琼脂糖凝胶。（3）样品准备：①取DEPC处理过的500ul小离心管，依次加入如下试剂：10xMOPS缓冲液2ul，甲醛3.5ul,甲酰胺（去离子）10ul，RNA样品4.5ul,混匀。②将离心管置于60℃水浴中保10分钟，再置冰上2分钟。③向管中加入3ul上样染料，混匀。（4）上样。（5）电泳：电泳槽内加入1XMOPS缓冲液，于7.5V/ml的电压下电泳。（6）电泳结束后，在紫外灯下检查结果。RNA提取、电泳注意事项，有几点说得很好啊快速的操作，低温环境，少量取上清主要是抽提之后吸取上清时要特别小心，只要不把蛋白层吸出来就不会有RNase污染。分子克隆第二版343页,上关于提取RNA所用的玻璃容器的处理方法,是用前180度干烤8小时或更长时间;另一种方法是0.1%的depc水浸泡(37度2小时),然后灭菌水淋洗数次,100度干烤15分钟,然后高压灭菌除去depc.我们实验室一直是用170度考4小时,且不准离人,不准过夜,可能是怕烤箱长时间高温,线路老化会发生危险吧提取RNA所用的枪头，EP管。直接高压烘干即可。如果用0.1％DEPC处理，要在DEPC配置后振摇1小时后再浸泡枪头，EP管方有效。我做的都是将枪头泡在配制好的depc中，摇振过夜，然后倒掉depc注意要到干净，再高压，为了防止仍残留液体可120度干烤一会A.对于提取RNA来说,我认为关键的一点在于实验器材的准备.包括从最初的标本的制备,保存,以及之后的试剂的准备,匀浆器,镊子,tip头的去除RNase处理,尤其是去除RNase的DEPC处理步骤B.您在处死大鼠前,先准备好干净的冻存管(用1.5ml的Ep管也可以,就是后面您在从液...