1983年河北大学学报(自然科学版)第2期DTNB与蛋白质疏基的相互作用’张光兴《分子生物学研究室)提要本文讨论了DTNB与蛋白质琉墓相互作用的反应机理;概述了近年来对TNBA(CNT)若下性质的最新认识,对作为一种试剂用来测定蛋白质中的游离琉基或潜在琉墓方法的可靠性的某些问题也作了探讨。许多天然蛋白质中含有游离疏基(freesulfhydrylgroups)或潜在的(potential)琉基。在蛋白质中,琉基往往以活性功能基(functionalgroups)的形式参与酶的催化或参与辅助因子的结合或参与蛋白质活性构象的维持。研究蛋白质琉基的数量和性质是近代生物化学和分子生物学获得某些结构信息(5truot盯aliuformation)的重要手段之一。现今已知用来作用蛋白质琉基的试剂大约有60多种,有各种二硫代物(disulfides)被用来测定蛋白质琉基‘其中,EUman’)试剂(DTNB).是蛋白质琉基最为专一的试剂,也是公认地、最广泛地用来测定琉基的试剂。一。反应机理DTNB与蛋白质琉基相互作用形成有色的硫酚阴离子(CNT)’或称5一硫代一2一硝基苯甲酸(盐)朔离子(TNBA).和混合的二硫代物(mixeddisulfidos)5一硫代一2一硝基苯甲酸(盐)蛋白(TNBP),).:PS-/COO-S一《二)一NOZ十lS/COO-S一<仁少一NO,-~)(TNBA)(A)一(多一N02\eoo-(琉基蛋白质)(DTNB)P一S一S一《身一NO:\eoo-(TNBP)TNBA杨蔡个共振稳定的硫酚盐阴离子(thiophe”“late“nio”)的存在,上述反应的平衡趋于右侧(K平、14,25℃)2》。因此,在有稍微过量的Ellman试剂存在下(PHS.0或8.1)上渗反应实际上是不可逆的,并有大量的、有色的硫酚阴离子形成。这样,作为该反.此文曾彝钾83年1。月成都举行的第一次全国工业生化学术会议卜宜读过,尽尽应琉基数的一种测量,可用分光光度法进行测定。创loan试剂通常是溶解在pH.8.o的磷酸盐缓冲液或Tr:5缓冲液中使用的,具浓度为10mM(o.01M),DTNB可以添加到含有lmM的EDTA‘.相当子片一10倍的疏基数的蛋白质溶液中。(EDTA在反应混合物中的作用不只是保护疏基不致氧化,而且也是为了防止某些金属离子影响颜色的进展)。DrNB作为测定蛋白质琉基的一个有用的试剂,上述反应有如下特点”:1)DTNB和TNB人在水中的可溶性(Solubslity)。2)反应的绝对专一侧:Absol。亡。:poef[ieity),3)使用比色测量的适用性(adaptability).4)反应的灵敏性(Serlsitivity)和5)反应的准硫性(aecuracy)。山71年,尺。byt完整地提出了DTNB与蛋白质疏基和二硫基相互作用的反应机理J’.(l)P一S·+pHS.l/CoO-一-一,P一S一5一仁〕一NO:十S一仁》一NOZ\eoo-卜(2)F一S一5厂一、一尸+仁少一NO,·一P一S一S一仁》一NOZ,P一S-\c00\coo-产“’P一5’心/C(〕。-仁少一NOZ/CO。-一p一g一只一仁;)一NO:(B)<多》一Nu:\eoo-十S-一仁少一NO才\c00-十DTT.\生(4”P一只一三仁少一NO:—--一一,3P一S-\coopHzo.5吧仁)付O\七00-S八O十上述反应的总反应式为:/COO-‘5,P一S一P一s一s一。十21一仁少一N。?S一屯长盘只p只丢b屯乡一N02\eoo-但是,许多工作者都认为,蛋白质的兢基部分与Enma。试剂反应以后,剩余的疏基可能参与以下两个竞争的反应之一:一,它们可能与剩余的Elman试剂按照反应式(B)一(1)继续进行,第第子内反应在有利的空间条件下,它们以混合二硫代物一TNB一蛋白的形式进行快速地分释放出硫酚阴离子门、NBA)并同时形成新的蛋白质二硫代物:P一S一S一仁》一NO,S一p/l一‘\亏+S一趁叠一NO:\COO-(C)}S-\COO-上述的分子内反应已在许多蛋白质中观测到。‘,’.)’。,二、TNBA(CNT)的某些性质〔一)共振稳定性:上述反应所生成的硫酚阴离子,其硫原子上的电荷在阴离子与酮式结构之间通过共振转移(resonanttransition)而稳定化:/CoO一/COO-S一仁)一NO:一S一仁>一NO:-该阴离子在25℃和0.1离子强度下的PKsH值为4.4。,,(二)摩尔消光系数(。):每一个蛋白质疏基无论是参与反应(A)、(B)一(4),还是反应(C)都能释放出等当量的TNBA。黄颜色的TNBA阴离子在412nm波长处有最大吸收值,而Elloan试一剂本身的最大吸收波长在325nm(。=15,oooM一’em一’)8)。关于TNBA的。值,多年来,许多论文中都取13,60M一‘cm一’。这个值最早是由Enman确定的‘’。1958年,Elman确定对硝基苯硫酚阴离子(TNPA)或称为硝基苯硫酚盐(NTP).的。值为25,600M...
