第一向等电聚焦系统VIP免费

第一向等电聚焦（IEF）图示：EttanIPGphor3等电聚焦仪器和EttanIPGphor3控制软件双向电泳的第一向IEF电泳采用IPGphor，实验将变得很简单。IPGphor包括半导体温控系统(18°C-25°C)和程序化电源(8000V，1.5mA)。可采用普通型胶条槽一步完成胶条的水化、上样和电泳，大大减少操作步骤。IPGphor一次可进行12个胶条槽的电泳(7,11,13，18，24cm)，因采用高电压(8000V)，可缩短聚焦时间。最新推出的通用型杯上样胶条槽因采用可移动的上样杯和电极，适合任何长度的IPG胶条，尤其适合极性等电点蛋白的分离。1．IPG胶条的水化和电泳（1）仪器：IPGphor（2）试剂：水化液（8M尿素，2%CHAPS，15mMDTT和0.5%IPG缓冲液）：水化液需当天新鲜配制(可配成储液分装-20℃保存，但不可反复冻融，尿素溶液加热温度不能超过37°C，否则蛋白会发生氨甲酰化)。（3）实验步骤：1）用样品溶解缓冲液(9M尿素，4%CHAPS，2%IPG缓冲液，40mMDTT，40mMTris-base)溶解样品。蛋白质上样浓度不要超过10mg/ml(若浓度过高，可以加Lysisbuffer稀释)，否则会造成蛋白质的集聚或沉淀。2）吸取适量(见表2.1)含有样品的水化液放入标准型胶条槽中，为确保样品充分进入胶条中，不要加入过量的水化液。表2.1IPG胶条所需水化液体积3）从酸性端（尖端）一侧剥去IPG胶条的保护膜，胶面朝下，先将IPG胶条尖端(阳性端)朝标准型胶条槽的尖端方向放入胶条槽中（酸性端抵住胶条槽底端），慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，最后放下IPG胶条平端(阴极)，使水化液浸湿整个胶条，并确保胶条的两端与槽的两端的电极接触。4）IPG胶条上覆盖适量（1.5mL）ImmobilineDryStrip覆盖油（从两侧往中间加），盖上盖子。5）将标准型胶条槽的尖端背面电极与IPGphor仪器的阳极平台接触；胶条槽的平端背面电极与IPGphor仪器的阴极平台接触（在此过程中，需用水平仪检查平台是否平衡，然后用两块白色条形板压在胶条槽上，最后盖上IPGphor的盖子）。6）设置IPGphor仪器运行参数：IPG胶条水化的电压，温度和时间；等电聚焦电泳时的梯度电压和温度。电泳参数见表2.2。表2.2：IPGphor运行条件步骤电压时间S1Stp30V11:00HrS2Stp100V1:00HrS3Grd1000V1:00HrS4Grd8000V2:00HrS5Stp8000V50000VhrS6Stp500V12:00Hr低电压时水化，有利于高分子量蛋白进入胶中，并减少蛋白形成聚集体。7）IPG胶条水化后可自动进行等电聚焦电泳。8）暂时不进行第二向的IPG胶条可夹在两层塑料薄膜中于-80°C保存几个月。注意：不推荐每条IPG胶条的电流超过50μA，因为这有可能产生过多的热量且有可能损坏胶条和槽，IPG胶条甚至会烧胶。附注：一向等电聚焦电泳需21-22h第一向等电聚焦电泳参数设置参数设置30V，11Hr100V，1Hr1000V，1Hr8000V，2Hr8000V，60000VHr500V，Hold2．IPG胶条的平衡IPG胶条平衡两次，每次15min。平衡缓冲液包括6M尿素和30%甘油，会减少电内渗，有利于蛋白从第一向到第二向的转移。第一步平衡在平衡液中加入DTT，使变性的非烷基化的蛋白处于还原状态；第二步平衡步骤中加入碘乙酰胺，使蛋白质巯烷基化，防止它们在电泳过程中重新氧化，碘乙酰胺并且能使残留的DTT烷基化(银染过程中，DTT会导致点拖尾"pointstreaking")。将IPG胶条轻轻润洗，并去除多余的平衡缓冲液，然后放入第二向SDS胶中。注：如果缩短平衡时间，会影响一部分蛋白从IPG胶条转移到SDS胶的效率。这种情况下建议在蛋白从IPG胶条转移到SDS胶后，将IPG胶条染色，以检查是否所有蛋白都已离开IPG胶条。（1）仪器：平衡管(200mm长,20mmi.d.),Parafilm,水平式摇床（2）实验步骤：1）使用前每10ml平衡缓冲液中加入0.1gDTT(相当于平衡缓冲液I)，取出IPG胶条分别放入平衡管中(支持膜贴着管壁，每个平衡管中放入一条IPG胶条)，用Parafilm封口，报纸盖上平衡管，避光，在水平式摇床上摇晃15分钟，倒掉平衡缓冲液I。2）每10ml平衡缓冲液加入0.3g碘乙酰胺(相当于平衡缓冲液II)。将IPG胶条转移至平衡缓冲液II中，用Parafilm封口，报纸盖上平衡管，避光，在水平式摇床上摇晃15分钟。（注：平衡缓冲液Ⅰ和Ⅱ用同一平衡管，即先用DDT平衡，缓缓地倒掉DDT，小心别把IPG胶条倒掉，再加入IAA进行平衡即可。每根胶...