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第35卷第4期2005年12月工业微生物Industia【Microbi。b日Vd35No4Dec2005复合淀粉酶酶解生淀粉机理探讨姚卫蓉，姚惠源(江南大学食品学院，无锡214036)摘要以生土豆淀粉为原料，考察了复合生淀粉酶水解机制。发现单个糖化酶的酶解遵循MichaeliS_M∞t∞机制，而*淀粉酶的酶解不遵循Mchaelis-M∞ten机制；水解过程中复合酶酶解产物d[G]／dt的变化说明*淀粉酶能很好地协同糖化酶水解生淀粉，其效果不仅仅是两者的简单相加。关键词：糖化酶；a一淀粉酶；协同作用；生淀粉根据作者的研究⋯，发现用具有生淀粉活性的糖化酶和”淀粉酶协同作用能很好地形成多孔淀粉。其中人们对生淀粉糖化酶的作用机理已有了一定的了解。生淀粉糖化酶水解生淀粉与水解糊化淀粉的机理与方式有相同的地方，即都是从非还原末端外切淀粉的a一1，4一葡萄糖苷键和a．1，6、葡萄糖苷键，但也存在着很大的差别”J。生淀粉颗粒在水中由于其表面与水分子形成氢键，从而形成水束，生淀粉颗粒表面大量的水束形成了一层水分子无法通过的水束层。只有当温度升高时水束层被破坏，水分子渗人淀粉颗粒，使淀粉颗粒膨胀与糊化。人们称之为“水束隔离模式(water-cIusterdlss。ciatingmod—e1)”。因此，酶是否能与生淀粉颗粒表面结合是水解生淀粉的关键”1。生淀粉*淀粉酶即*淀粉酶，是内切型淀粉酶，它作用于淀粉时是从淀粉分子的内部任意切开a一1，4键，使淀粉分子迅速降解，失去了粘性以及和碘的呈色反应，同时使水解物的还原力增加。虽然国外研究人员已经将近50种不同来源的a一淀粉酶的肽链进行了空间结构、氨基酸序列分析，并将相应的DNA序列破译”J。但是对n一淀粉酶水解生淀粉的作用机理还不十分清楚，国内外的报道很少。糖化酶和a靛粉酶复合水解生淀粉能形成多孔淀粉，但对其作用机理仍然不是十分清楚，很难用实验数据来确切描述这一过程。本文试图从一些侧面对糖化酶和*淀粉酶复合水解淀粉形成多孔淀粉的机理作一些探索，考察单个糖化酶、单个*淀粉酶以江苏省基础研究计划(自然科学基金)资助项目(编号：BK200340】)。作者简介：姚卫蓉‘1970～’·女，副教授。E圳11：”“”㈣ng。“4鬯3秽及两者的复合形式分别作用生淀粉的情况，希望从动力学机制上解释酶解机理。l材料与方法1．1材料黑曲霉糖化酶：购自Sigma公司，酶活6000U／mL，在pH4．5，55℃条件下3min由淀粉释放1Onlg葡萄糖为lu；杆菌*淀粉酶：购自Sigma公司，酶活51U／rng，在pH69，20℃3min由淀粉释放1．OH培麦芽糖为1u；土豆淀粉：荷兰产风车牌。1．2单酶或复合酶酶解反应分别取不同量或不同配比的糖化酶、*淀粉酶加入到不同底物浓度的10mL反应液中，42℃下反应不同时间，加4％的NaOH溶液1mL终止反应，用NeIson—Somogyi方法”161测定反应液中还原糖的浓度。1．3复合酶酶解的d[G]／dt．t曲线用本文附件“Mathematical源程序”，分析复合酶酶解反应，对葡萄糖浓度变化数据进行拟合，得到复合酶酶解产物葡萄糖浓度随时间的变化规律(d[GJ／dt．t)。2结果与讨论在本研究中利用生淀粉糖化酶作用生淀粉制备多孔淀粉时，使用了a一淀粉酶一起作用，水解能力得到了提高，多孔淀粉的性能也得到了提高⋯。a一淀粉酶的协同作用是如何体现的呢?下面试图从酶解万方数据第4期I业微生物第35卷动力学方面阐述“一淀粉酶与糖化酶的协同作用。分别考察单一糖化酶、单一a。淀粉酶以及两者的复合形式作用生淀粉的情况。由于制备多孔淀粉时一直用工业酶制剂，而研究酶解机理必须用纯酶。因此，选用了与所用工业酶制剂同一菌种所产的纯酶进行实验。文献报道”J，生淀粉酶水解生土豆淀粉的水解度最低，反应速度最慢，能很好地呈现酶解初期的动力学。因此，决定选用土豆淀粉作为酶解底物。2．I糖化酶的MichaeIis．Meten常数由于本研究所用复合酶主要为糖化酶，在研究复合酶酶解时，首先要考察糖化酶水解动力学机制。用10u的糖化酶分别水解不同浓度土豆淀粉(5至50mdmL)，以葡萄糖为指标测定水解速度，并以Lineweav“一Burk方式作图(即以1／V对1／[S]作图)，结果见图1。图1单一糖化酶的Lineweaver—Burk图(10U糖化酶)由图1可知，糖化酶水解生土豆淀粉的1／V与l／[Sj成一直线，符合Michaeb...