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高活性蛋白酶乳酸菌的筛选VIP免费

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深圳大学综合性、设计性与探索研究性实验课程名称:微生物学实验实验项目名称:高活性蛋白酶乳酸菌的筛选学院:生命科学学院专业:生物科学指导教师:韩庆国报告人:魏高斌学号:2011300161班级:5实验时间:2013-12-14~2013-12-31实验报告提交时间:2014-01-03高活性蛋白酶乳酸菌的筛选[摘要]本实验利用添加了碳酸钙的改良乳酸菌的固体培养基通过初筛、复筛,火腿肠中得到一种能分解碳酸钙的菌种,对该菌种进行了形态学鉴定,确定此菌株属乳酸菌的乳酸球菌属。通过单因变量的改变,不断筛选分离得到高蛋白酶活性的乳酸菌种。[关键词]乳酸菌、筛选、蛋白酶;乳酸菌具有多种生理功能,乳酸菌具有提高食品营养价值,改善食品风味,延长保存时间,对人体具有多方面的保健作用,如能调节肠道菌群,维持体内微生态平衡,抑制肠道内腐败菌生长繁殖,消除体内有毒物质的产生,改善便秘,降低胆固醇水平,改善肝功能缓解乳糖不耐症,改善维生素代谢,增强免疫,抗肿瘤,抗突变等,在畜牧业方面,乳酸菌还有增膘作用等,引起了人们广泛的研究兴趣,本文利用简单的培养分离纯化方法,利用单因素变量,将高蛋白酶活性的乳酸菌从肉类制品中分离筛选出来,这类高蛋白酶菌种在食品工业或畜牧业上有一定的意义。1.材料与方法1.1.材料菌种来源:市售金锣火腿肠;试剂:蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、柠檬酸二铵、葡萄糖、乙酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰、吐温-60、去离子水、琼脂、碳酸钙、结晶紫染液、碘液、番红染液、干酪素;器材:锥形瓶、烧杯、试管、培养皿、培养皿桶、移液管、洗耳球、接种环、移液器、移液器头、超净工作台、显微镜、电炉、分析天平、高压蒸汽锅、恒温培养箱等。1.2.培养基配方1.2.1.改良乳酸细菌固体培养基(MRS)蛋白胨10.0g,牛肉膏8.0g,酵母膏4.0g,柠檬酸二铵2.0g,葡萄糖20.0g,吐温-601.0ml,乙酸钠5.0g,磷酸氢二钾2.0g,硫酸镁0.2g,硫酸锰0.05g、琼脂20.0g,碳酸钙3%,pH6.0~6.8,加蒸馏水至1000ml。1.2.2.乳酸菌蛋白酶活性检测的固体培养基蛋白胨10.0g,牛肉膏8.0g,酵母膏4.0g,柠檬酸二铵2.0g,葡萄糖20.0g,吐温-601.0ml,乙酸钠5.0g,磷酸氢二钾2.0g,硫酸镁0.2g,硫酸锰0.05g、琼脂20.0g,0.5%干酪素,pH6.0~6.8,加蒸馏水至1000ml。1.3.方法1.3.1.改良乳酸细菌培养基(MRS)配置在室温的条件下,按照配方用分析天平分别使用称量纸称量:蛋白胨10.0g、牛肉膏8.0g、酵母膏4.0g、柠檬酸二铵2.0g、葡萄糖20.0g、乙酸钠5.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g,使用量程为1ml的移液管量取吐温-601.0ml到1000ml烧杯中,与以上的全部试剂混匀,加去离子水至1000ml,在电炉上稍微加热搅拌,以助于吐温-60的溶解,以制成pH6.0~6.8的液体培养基。分装于500ml锥形瓶中,每瓶200ml。按配方称取琼脂4g、碳酸钙6g于一个锥形瓶中制备成筛选乳酸细菌的固体培养基;按配方称取琼脂4g、干酪素1g制备成乳酸菌蛋白酶活性检测的固体培养基;锥形瓶用干净的胶塞和报纸封口。包扎若干洁净试管,准备移液器头,培养皿,2瓶100ml去离子水,于高压蒸汽锅121℃灭菌15min后冷却至50℃待用。1.3.2.乳酸菌的分离和纯化1.3.2.1.乳酸菌的分离在超市购买金锣火腿肠,用万分之一的天平称取10g,在超净工作台中减碎放入装有90ml冷却的无菌水的150ml锥形瓶中,并充分混合均匀,即为稀释度为10-1的样品液,另取3根无菌试管,用移液管和洗耳球各加入10ml无菌水,使用无菌的1ml移液器将样品稀释至10-2、10-3、10-4,分别吸取10-1、10-2、10-3、10-4样品稀释液1ml于培养皿中,然后倒入冷却至50℃后碳酸钙MRS固体培养基摇匀,待冷却后取出倒置于恒温培养箱中37℃、无氧条件下培养1-2天,并将剩余培养基倒平板,待用。1.3.2.2.乳酸菌的纯化从培养了1-2天的碳酸钙MRS培养基上挑取有透明圈的菌落,进行革兰氏染色,取菌种培养物常规涂片、干燥、固定,滴加结晶紫初染1-2分钟,水洗,再用碘液冲去残余水渍,并用碘液覆盖媒染约1分钟后水洗,并用滤纸吸取载玻片上的残水,将载玻片倾斜,在白色背景下,用滴管流加95%的乙醇脱色,直至流出的乙醇无紫色时,立即水洗,最后用番红液复染约2分钟,水...

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