生物技术通讯!"##"$%&’(&)#"*+’)!),-./0123’/145678499:简并;*$!<=>=?=76@=;*$"是49世纪A9年代初建立的用于细胞遗传学中特异扩增B’C的技术方法##=0=?DEF等人也称其为简并寡核苷酸引物;*$!<=>=?=76@=/0D>/?EG0=/@D<=HI7DJ=<;*$$B);K;L$"M2N#本文中将凡是应用简并性寡核苷酸引物进行的;L$反应都称之为简并;L$#简并;L$根据密码子存在的简并性设计寡核苷酸引物$进行聚合酶链式反应#由于此种;L$不需要知道要扩增B’C片段的核苷酸序列$因此该技术倍受青睐$在多个领域都有广泛的应用#本文就简并;L$的基本原理及引物设计方案%存在问题及解决办法和应用研究进展做一简述#2基本原理及引物设计简并;L$与一般;L$的不同之处在于$一般;L$中的引物是用给定的核苷酸序列设计的两条特定的引物$而在简并;L$中用的是由多条不同核苷酸序列组成的混合引物库#其基本原理就是根据氨基酸序列设计两组带有一定简并性的引物库$从不同生物物种中扩增出未知核苷酸序列的基因#简并引物库是由一组引物构成的$这些引物有很多相同碱基$在序列的好几个位置也有很多不同的碱基$只有这样$才会和多种同源序列发生退火$以实现;L$扩增#例如ICFI#O7C06,0P,0?,0E3Q#,,,C-C*’,*’,,’*C$,CRQ其中-代表#或*$$代表,或C$’代表C或,或*或##这样可以得到43S种不同的序列#在引物中有越多的-或$或’$引物的简并程度就越大#引物设计是简并;L$的关键环节$值得仔细考虑#设计引物之前$最好画出要扩增基因所在基因家族所有成员的比对图$标出保守的氨基酸残基$并标记出编码每个氨基酸的密码数目#设计简并;L$引物需要两个必要条件$一是两段保守的氨基酸序列或B’C序列!保守性不必为T99U"$保守氨基酸区段最好不要以丝氨酸%精氨酸和亮氨酸为主’二是蛋白’端序列已知$一般蛋白末端测序得到的序列足够用来引物设计#在引物设计中$最重要的是要尽量降低引物库的简并性程度$一般简并性程度在T999VT9999倍之间较好#减少引物简并性的方法主要有&!选择最佳的引物位点&在氨基酸序列中选定合适的引物位点需要考虑两点$一是此位点最好在编码最保守氨基酸的密码子序列上$二是虽然氨基酸保守性不高$但其密码子简并程度要低’"用次黄嘌呤作为(中和)碱基&次黄嘌呤是@$’CF中自发产生的可以与胞嘧啶%胸腺嘧啶和腺嘌呤形成碱基对的嘌呤碱基#尽管此碱基与腺嘌呤形成的碱基对非常不适合双链B’C的结构$但在螺旋结构的突出部分存在此碱基对是一种能量的补偿$有利于B’C结构的稳定#在简并;L$引物设计中$在:种碱基都需要合成的位置用次黄嘌呤代替$每使用一次次黄嘌呤就可以将引物库简并性降低至TW:#但是会发生&X,的错误配对$因此必须假定在引物其他位置的精确碱基配对会克服这一问题#大多数寡核苷酸合成仪可以合成包含次黄嘌呤核苷的寡核苷酸$因此合成含次黄嘌呤核苷的寡核苷酸不是问题’#在同一个位置分别使用多个寡核苷酸引物库&为了尽量降低引物库的简并程度$针对一段特定的密码子序列设计合成两个文章编号YT99AK9994Z499:[94K9T\4K9:综述简并;L$及其应用史兆兴!王恒樑!苏国富!黄留玉军事医学科学院生物工程研究所!北京T999\T摘要!简并;L$技术是根据同源蛋白的氨基酸序列扩增到同源基因的核苷酸序列!具有独特的优点"成功进行简并;L$的关键是设计好两组引物库和对反应条件进行优化"由于简并;L$自身的特点!在新基因的克隆#基因表达检测#病毒检测和基因组研究中有其广泛而独特的应用"关键词!简并;L$$简并性引物中图分类号Y]\^3文献标识码!C!"#"$"%&’"()*&$+,’-&../,0&’,1$!"#$%&’()*+,-./01"2+,(3*&+,-!415’(65-"4/017*5(85&?F@D@E@=/_(D/@=GO?/0/>P‘a=DbD?>T999\T‘*OD?623-’%&0’-4#O=6
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