还原变性核糖核酸酶在疏水性液-固界面上的复性VIP免费

2010年8月色语V01．28No．8August2010ChineseJournalofChromatography786—789研究论文DOI：10．3724／SP．J．1123．2010．00786还原变性核糖核酸酶在疏水性液一固界面上的复性Refoldingofreduced／denaturedRNaseAonthehydrophobicliquid—solidinterfaceBIJing，BAIQuan‘，WANGJun，WANGLili“—“缆i(KeyLaboratoryofSyntheticandNaturalFunctionalMoleculeChemistryofMin拈tryofEducation，j}}InstituteofModernSeparationSciences，KeyLaboratoryofSeparationSciencein0日熬§黪镕。。㈣#㈣∽。‰《#；《一+Shaa黼．iProvince，NorthwestUniversity，Xi’an710069，China)t∽‰^：％。。；燃，‰。≯$≈。ii凌Abstract：Therenaturationofthereduced／denaturedRNaseAonthehydrophobicliquid—solidinterfacewasinvestigatedusinghydrophobicinteractionchromatography(HIC)．Theeffectsofureaconcentrations，theratiosofreducedandoxidizedglutathiones(GSHandGSSG)，thepHofmobilephaseandproteinconcentrationsontherefoldingefficiencyandmassrecoveryofthereduced／denaturedRNaseAwereinvestigatedindetail．Theresultsindieatedthatthereduced／denaturedRNaseAcanberefoldedcompletelyundertheoptimizedconditionsofpH8．0，2。0moVLureaandtheconcentrationratioofGSH／GSSGof8：1inmobilephase．Whenthedena-turedproteinwasattheconcentrationof5．0mg／mL，thebioactivityefficiencyandmassrecov-erieswere98．0％and61．9％for8．0mol／Lurea—denaturedRNuseA，respectively；and100．1％and56．8％for7．0moVLguanidinehydrochloride(GuaHCl)一denaturedRNaseA，re—spectively．ItprovesthatHICisapowerfultoolandnewapproachforproteinrefolding．Keywords：proteinrenaturation；hydrophobicinteractionchromatography(HIC)；reduced／denatured；RNaseA用大肠杆菌(E．coli)表达的重组蛋白质，由于过表达和在表达过程中缺乏某些复性因子和酶，外源性蛋白质因为疏水作用相互聚集容易形成难溶于水的包涵体(inclusionbody)。包涵体不溶于水，但可溶于7．0mol／L的盐酸胍或8．0mol／L的脲等强变性剂中，因此蛋白质必须经过复性才能得到具有生物活性的目标蛋白质⋯。这就提出了用高浓度变性剂提取目标蛋白质后的复性问题。通常采用稀释法或透析法进行蛋白质复性，但复性效率一般仅为5％～20％，且难与杂蛋白质分离。所以蛋白质的}通讯联系人：白泉，教授．博士生导师．主要研究方向为生物大分子的分离纯化．E—mail：baiquan@llwu．edu．cn．基金项目：国家“863”计划项目(No．2006AA022227)和陕西省重点实验事重点科研项目(05JS62)．收稿日期：2010-04-08万方数据第8期毕晶，等：还原变性核糖核酸酶在疏水性液一固界面上的复性·787·复性问题已成为生物工程产业化的技术瓶颈。此外，95％的蛋白质中含有二硫键，如何提高还原变性蛋白质在复性过程中二硫键的正确对接，对蛋白质药物的纯度和产率的提高及生物工程技术的发展具有非常重要的意义。液相色谱(LC)是生物大分子分离纯化的主要手段，自1991年疏水作用色谱(hydrophobicinter-actionchromatography，HIC)首次用于蛋白质复性研究旧’以来，国内外用LC进行蛋白质复性的研究方兴未艾¨’4o，现已发展成为研究蛋白质复性的新方法——蛋白质复性液相色谱法(proteinfoldingliquidchromatography，PFLC)”1，并已有人阐述了PFLC研究蛋白质复性的分子学机理161。与通常的复性方法相比，PFLC在一个色谱过程中可同时实现4种功能：(1)快速除去变性剂；(2)分离杂蛋白质；(3)目标蛋白质复性；(4)回收变性剂H’。PFLC已成功应用于多种变性蛋白质和重组蛋白质药物的复性并同时纯化研究一。1“。本实验室采用醋酸溶液对样品进行透析处理并冻干后再进行复性的PFLC方法，对还原变性核糖核酸酶A(RNaseA)的复性进行了一些研究，但蛋白质易形成沉淀，发生分子构象变化，从而导致复性效率和质量回收率较低n4’1引，且无法模拟包涵体蛋白质变性提取的真实过程。本文以RNaseA为模型蛋白质，采用HIC技术，深入研究了还原变性RNase...