第25卷第2期2006年4月电子显微学报JournalofChineseElectronMicroscopySocietyVol225,No122006204文章编号:100026281(2006)0220168204复合侵染的蚕豆黄花叶病病原诊断谢礼1,刘文洪2,洪健13,周雪平1(1浙江大学生物技术研究所,浙江杭州310029;2浙江中医学院,浙江杭州310053)摘要:应用透射电镜、ELISA和RT2PCR技术对浙江丽水的蚕豆黄化花叶病株进行了病原诊断,电镜负染色发现病株汁液中存在线状和球状两种病毒粒子,线状粒子长度在600nm～800nm的占73%,球状粒子直径约26nm;超薄切片观察到细胞质中存在Ⅱ型风轮状内含体及大量电子致密无定型体,还有线粒体增生聚集和膜结构的增生,两类细胞病变现象出现在相邻细胞中;用BBWV2的单克隆抗体对病汁液ELISA检测结果为阳性反应;用Potyvirus通用引物进行RT2PCR检测有117kb特异性扩增片段产生。根据以上结果诊断病原为蚕豆萎焉病毒2(BBWV2)和菜豆黄花叶病毒(BYMV),二者为复合侵染。关键词:蚕豆;蚕豆萎蔫病毒2;菜豆黄花叶病毒;病原诊断中图分类号:S431112;S432141;Q336文献标识码:A收稿日期:2005208229;修订日期:2005212231基金项目:国家自然科学基金资助项目(No.30270873,No.30370305).Foundationitem:NationalNaturalScienceFundationofChina(No.30270873,No.30370305).3通讯作者:洪健(1957-),男(汉族),浙江宁波人,教授,博士研究生导师.E2mail:jhong@zju.edu.cn发生在我国侵染蚕豆(ViciafabaL1)的病毒病原已报道9种,分别是:蚕豆萎蔫病毒2(BBWV2)、蚕豆杂色病毒(BBSV)、芜菁花叶病毒(TuMV)、大豆花叶病毒(SMV)、菜豆黄花叶病毒(BYMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、菜豆卷叶病毒(BLRV)和蚕豆真花叶病毒(BBTMV)[1,2]。田间症状主要表现为褪绿花叶型,萎蔫坏死型和黄化卷叶型三类。当两种或两种以上病毒复合侵染时症状表现更为复杂,仅靠田间症状观察和传统生物学测定难以对病原作出正确诊断,而血清学及分子检测对于复合病原也有局限性。应用负染色和超薄切片电镜观察,则可以对病毒形态及其归属作出初步判断,再结合血清学和分子生物学技术,就能对复杂的病原进行快速诊断,得到可靠结果。2005年3月在浙江丽水调查豆类病毒病害时,采集到一株症状为褪绿黄化花叶的蚕豆病株,与常见的BBWV2感染症状明显不同。经透射电镜观察发现病组织汁液中存在高浓度的线状和球状两种病毒粒子,结合超薄切片细胞病理观察、酶联免疫吸附(ELISA)和反转录聚合酶链式反应(RT2PCR)检测对该病株的病原进行了鉴定,判明是由蚕豆萎蔫病毒2和菜豆黄花叶病毒复合侵染所引起。1材料与方法111病叶汁液负染色电镜观察采自浙江丽水的蚕豆(Viciafaba)病叶经研磨后,铜网蘸取组织汁液,用2%磷钨酸(pH617)负染色,在JEM21230型透射电镜下观察,Gatan792型CCD记录图像。112病毒粒子形态统计病毒粒子的负染色图像用捷达公司JD2801形态学图像分析软件进行线状粒子长度和球状粒子直径测量,分别统计100个病毒粒子。113病叶超薄切片电镜观察取病叶褪绿黄化部位切成4mm×2mm小片,215%戊二醛固定过夜,011molΠL磷酸缓冲液漂洗后用1%四氧化锇固定2h,乙醇梯度脱水,Spurr低粘度包埋剂包埋。超薄切片经柠檬酸铅和醋酸铀双染色,透射电镜观察和记录图像。114ELISA检测采用我们实验室制备的BBWV1和BBWV2单克隆抗体,参照吴建祥等的方法[3]对病叶汁液进行单抗夹心2ELISA检测,以保存的BBWV1和BBWV2毒源为阳性对照,以健康蚕豆叶片为阴性对照。115RT2PCR检测病叶总RNA提取:取10mg鲜叶放入011%DEPC水处理过的研钵,加入200μL的PBST充分研磨,把上清液转移到015mL离心管中,常温下静置15min,弃上清,用200μL的PBST洗3次,加入DEPC处理水915μL,80℃2min,迅速置于冰上待用[5]。以病叶总RNA为模板,以引物M4T[5′2GTTTTCCCAGTCACGAC(T)1523′]反转录合成cDNA第一链。取10μL合成的cDNA为模板,分别用引物M4(5′2GTTTTCCCAGTCACGAC23′)和Sprimer(5′2GGXAAYAAYAGYGGXCAZCC23′,X=A,G,C或T;Y=T或C;Z=A或G)进行PCR扩增,1%琼脂糖电泳检测PCR产物[4]。2结果与分析211病毒粒子形态病叶汁液经负染色后在电镜下可观察到两种病毒粒子。一种为二十面体对称的球状粒子,无包膜,直径约26nm,有的视野中病毒粒子聚集成堆分布(图1)。另一种为柔软弯曲的线...
