黑曲霉S4生淀粉糖化酶的分离纯化及其特性VIP免费

f0吕rff微生物学报船(2)：10B—Il4，1993^ctnMicrobiologica~inica卵)黑曲霉S4生淀粉糖化酶的分离纯化及其特性．方善康周风臻山融舭辨黼”⋯伽口占用酒精沉淀、$ephsdexG-IO0凝胶过滤和离子交换柱层析等步骤对黑曲霉(Asper~illm~耐pr)s4的生淀粉糖化酶进行了分离，纯化出三十电冰纯组分(or、GII和GIII)，纯化倍数分别为j．4、6．0和i．9；酶话收率分别为i0．2％10．7％和i．9％。三个坦分均为酸性糖蛋白，其糖含量分别为l1．68％、8．6％和3．6％pl值分别为‘．0、3．9和3．；分子量分别为135000、62000和57500。通过对这三十组分的性质和它们对生淀粉作用的Vl／K值的铡定，探讨了生淀粉糖化酶的作用机理。关键调黑曲霉；生淀粉糖化酶葡萄糖精化酶(Ec3．2．1+3，l，4一a—D葡聚糖水解酶)是一胞外外切酶．它可以连续不断地从淀粉和糖元的非还原末端除去葡萄糖单元。该酶的主要产生菌为霉菌，工业中常用的是黑曲霉。很多酶都可水解蒸煮糊化淀粉产生葡萄糖，但不一定能水解生淀粉。葡萄糖糖化酶可水解生淀粉，简称为生淀粉糖化酶。它已被用于生淀粉质原料的无蒸煮酒精发酵，可节约总能耗的3O一4O弼，因而对生淀粉糖化酶的研究日益得到重视。坦由于它的较大的分子量及其组分的复杂性等原因，有关黑曲霉生淀粉糖化酶的结构与功能之间的关系，至今尚未研究清楚。为此我们对黑曲霉s4的生淀粉糖化酶进行了分离纯化，研究它的理化性质，并探讨其结构与功能的关系。材料和方法(一)材料I菌种：黑曲霉s4(A：pergillu~nigers4)由本实验室分离、保存。2．培养基：麸皮：水一1：l，lkg／cm2灭菌2O分钟。3．主要试剂：玉米淀粉、马铃薯淀粉、可溶性淀粉(浙江菱湖淀粉厂出品)；葡萄糖、DEAE—SephadexA一25、SephadexG-lO0(Pharamacia出品)；pH3．5一l0．0和0'H06—4．0的两性载体(LKB出品)；考马斯亮兰G-250、十二烷基硫酸钠、No．4透析袋(Fluka进口)；其它试剂均为A．R级。(=)方法1生淀粉糖化酶活性测定：以生玉米淀粉、甘薯淀粉和马铃薯淀粉为虔物，参照DNS法测定；以可溶性淀粉为底物，按Bringer法处理后，用Somogy~-Nclson法测定。车文于1991年4月9日收球‘国家七五攻关课题维普资讯http://www.cqvip.com2朝方善康等：黑曲霉s4生淀粉糖他酶的分离纯化及其特性在pH45、40~C’反应lO分钟，每分钟释放lmg还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量定义的一个活性单位。2．纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶活性的测定：把原酶液分别与这三种酶的底物(纤维素、木聚糖和果肢)按Bringer法处理后，用Somogyi—Nelson法测定。在pH~．540ac反应1小时，每分钟产生lmg葡萄糖(纤维素酶)、木糖(木聚糖酶)和半乳糖醛酸(果胶酶)所需的酶量分别定为一个活性单位。’3．蛋白酶活性的测定：按Hayashida方法。每分钟分解干酪素产生lmg的酪氨酸所需的酶量。定为一个活性单位。4．一淀粉酶活性的铡定：参照文献I31，吼每l0分钟释教lamol还原塘所需酶量定为1个活性单位。5．纯化酶组分总糖台量的测定：采用苯酚一硫酸法。6．纯化酶组分作用产物的纸屡析：将2嘶可溶性淀粉的酶解液，以葡萄糖为标准，接文献【7】进行纸层析。7．纯化酶组分纯度的鉴定：参照文献l8]，选用7弦的凝胶，以pH8．3的Tris一甘氨酸为缓冲液。8．旋光度的铡定：参照Yamssakl方法，测定酶与底物的混台物的旋光度变化。9．SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量：采用7．5瞄腔浓度，以肌球蛋白(MW205000)、a-半乳糖苷酶(Mw一116000)、礴酸化酶(WW一974ooX小牛血清清蛋白(Mw一6,000)和卵清蛋白(ww一45000)为标准蛋白。l0等电点的测定：先用pH3．5一l0．0的两性载体剥出样品的等电点的大体数值，再用pH2．6—40的两性载体细铡。一11．生淀粉糖化酶粗酶的制取：按怙规的酒精、丙酮沉淀方法，从黑曲霉s4的麸血提出液中制取生淀粉糖化酶粗酶。l2．K和v⋯的测定：按Takahashi方法坝6定o13蛋白旅度的测定：Foiin一酚法；溅280nm处的光吸收法口结果(一)黑曲霉S{的酶系活性该菌的各种酶活性的测定结果如表1(活性单位见材料与方法(二))o裹l礤灌串备锋酶的{苦性TabLeIEnzvmesact1Vitiesotcfudeextf●ct蛋自酶PrQttiⅢe酶种类楮化酶果腔酶纤维素酶术襄铐酶4一淀粉酶EnzymeGLuco~myIase酸性...