酶标ELISA综述VIP免费

酶标（ELISA）综述张传锋ELISA的发展ELISA是酶联接免疫吸附剂测定(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)的简称。自上世纪70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。ELISA技术原理1.抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。2.结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性。3.酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。4.受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。5.此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。6.加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。测定方法具有很高的敏感度（pg-ng/ml水平），并且重复性好。以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术ELISA的方法1.检测抗体的间接法2.双抗原/抗体夹心法3.检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法酶标的实验设计方法比较多，但是最常使用比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法ELISA检测方法1.Abs（吸收光）检测法2.荧光检测法�荧光强度（FI）�荧光寿命（FL）�荧光偏振（FP）�荧光共振能量转移（FRET）3.发光检测法�化学发光�生物发光其中发光有分为快速发光法（闪光法）、慢速发光法（辉光法）技术要点1.试剂的制备、材料的准备2.反应条件的选择3.操作的标准化试剂及材料的准备ELISA的主要试剂有1.固相的抗原或抗体2.酶标记的抗原或抗体3.与标记酶直接关联的酶反应底物固相载体ELISA反应中最常用的固相载体为聚苯乙烯材料，聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能。抗体或蛋白质抗原吸附其上后保留原来的免疫活性，聚苯乙烯为塑料，可制成各种形式。在ELISA测定过程中，它作为载体和容器，不参与化学反应。抗原、抗体和其它生物分子通过多种机制吸附至载体表面，这包括通过疏水键、流水/离子键的被动吸附,通过引入其它活性基团如氨基和碳基的共价结合，以及通过表面改性后的亲水键结合。酶标板•高结合力酶标板(HighBindingELISAPlate):经表面处理后蛋白结合能力大大增强,可达到400-500ngIgG/cm2,主要结合的蛋白分子量>10kD.使用该类板可提供敏感性,并可相对减少包被蛋白的浓度和用量,不足之处为较易产生非特异性反应.抗原或抗体包被后,以非离子去污剂无法有效地封闭未结合的部位,需使用蛋白作为封闭剂.•中结合力酶标板(MediumBindingELISAPlate):经表面硫水键被动与蛋白结合,适合作为分子量>20kD的大分子蛋白的固相载体,其蛋白结合能力为200-300ngIgG/cm2.由于该类板所具的仅与大分子结合的特性,适用于作为未纯化抗体或抗原的固相载体,可降低潜在的非特异性交叉反应.该类板可以惰性蛋白或非离子去污剂作为封闭液.•氨基化酶标板(AminatedELISAPlate):经表面改性处理后拥有带正电荷的氨基,其疏水键由亲水键取代.该类酶标板适合作为小分子蛋白的固相载体.使用合适的缓冲液和pH值,其表面可通过离子键与带负电荷的小分子结合.由于其表面的亲水特性和可通过其它交联剂共价结合的能力,可用于固定溶于Triton-100、Tween20等去污剂的蛋白分子.该类板的缺陷为由于降低了疏水性,一部分蛋白分子无法结合;此外,其表面需有效的封闭.由于亲水和共价的表面特性,使用封闭液必须能够与非反应性氨基集团和所选择的交联剂中任何官能基团如succinimide、aldehyde和maleimide发生作用。聚氯乙烯聚氯乙烯与聚苯乙烯是类似的塑料，也可作为ELISA固相载体，聚氯乙烯板的特点为质软板薄，可切割，价廉、但光洁度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有时也略高。UV分析板(紫外光分析板)聚苯乙烯和聚氯乙烯板在紫外区有很强的吸收不能用于蛋白核酸的定量。�Uv分析板可直接读取核酸及蛋白的浓度�在260nm/280nm低本底干扰�UV板价格昂贵一般在150RMB左右抗原和抗体抗原和抗体的质量是实验是否成功的关键因素。本法要求所用抗原纯度高，抗体效价高、亲和力强。�天然抗原（天然抗原取材于动物组织或体液、微生物培养物等，一般...