实验六、七 聚丙烯酰胺凝胶柱状电泳分离血清蛋白VIP专享VIP免费

实验六实验六聚丙烯酰胺凝胶柱状电泳分离聚丙烯酰胺凝胶柱状电泳分离血清蛋白质血清蛋白质指导教师指导教师刘建昌、池雪林刘建昌、池雪林一、目的一、目的11、掌握聚丙烯酰胺凝胶柱状电泳的原、掌握聚丙烯酰胺凝胶柱状电泳的原理、操作方法。理、操作方法。22、学会用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋、学会用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质。白质。二、原理二、原理““不连续系统”最大的特点在于大大提高了样品分不连续系统”最大的特点在于大大提高了样品分离的分辨率，这种电泳的主要特点是：（离的分辨率，这种电泳的主要特点是：（11）使用）使用两种不同浓度的凝胶系统；（两种不同浓度的凝胶系统；（22）配制两种凝胶）配制两种凝胶的缓冲溶液成分及的缓冲溶液成分及PHPH值不同；（值不同；（33）配胶缓冲液）配胶缓冲液与电泳槽中电泳缓冲液的成分、与电泳槽中电泳缓冲液的成分、PHPH值也不相同。值也不相同。在实验中，电泳凝胶分为两层：上层胶为低浓度的在实验中，电泳凝胶分为两层：上层胶为低浓度的大孔胶，称为浓缩胶，成胶的缓冲液是大孔胶，称为浓缩胶，成胶的缓冲液是Tris-HCLTris-HCL，，PH6.7PH6.7；下层胶则是高浓度的小孔胶，称为分离胶，；下层胶则是高浓度的小孔胶，称为分离胶，成胶的缓冲液是成胶的缓冲液是Tris-HCL,PH8.9Tris-HCL,PH8.9。电极缓冲液则。电极缓冲液则是是Tris-Tris-甘氨酸，甘氨酸，PH8.3PH8.3。可见，凝胶浓度、成胶。可见，凝胶浓度、成胶成分、成分、PHPH值与电泳缓冲液系统各不相同，形成了值与电泳缓冲液系统各不相同，形成了一个不连续系统。一个不连续系统。在不连续系统中电泳时，甘氨酸、蛋白质、盐酸在不连续系统中电泳时，甘氨酸、蛋白质、盐酸中的氯离子和溴酚蓝等均解离为阴离子，形成离中的氯离子和溴酚蓝等均解离为阴离子，形成离子流向阳极泳动。当电极缓冲液（子流向阳极泳动。当电极缓冲液（pH8.3pH8.3）中的）中的甘氨酸离子进入浓缩胶时，甘氨酸离子进入浓缩胶时，pHpH值降到接近于甘值降到接近于甘氨酸等电点（氨酸等电点（5.975.97），于是甘氨酸的解离度突然），于是甘氨酸的解离度突然降低，所带电荷明显减少，迁移率减慢。样品中降低，所带电荷明显减少，迁移率减慢。样品中蛋白质成分也进入浓缩胶，蛋白质成分也进入浓缩胶，pHpH值的改变虽对其值的改变虽对其解离度有影响，但比对甘氨酸小得多，其迁移率解离度有影响，但比对甘氨酸小得多，其迁移率比甘氨酸要大，而且浓缩胶的胶孔较大对蛋白质比甘氨酸要大，而且浓缩胶的胶孔较大对蛋白质分子不会造成阻碍。浓缩胶中的分子不会造成阻碍。浓缩胶中的Tris-HClTris-HCl中中ClCl离子则全部解离，其迁移率最快。于是在浓缩胶离子则全部解离，其迁移率最快。于是在浓缩胶中各种离子的迁移率形成：甘氨酸〈蛋白质〈溴中各种离子的迁移率形成：甘氨酸〈蛋白质〈溴酚蓝〈酚蓝〈ClCl离子的顺序。离子的顺序。甘氨酸分子进入浓缩胶后解离度的下降，造成移动甘氨酸分子进入浓缩胶后解离度的下降，造成移动离子流的突然缺失，出现电流减少电导率下降，然离子流的突然缺失，出现电流减少电导率下降，然而整个电泳系统中其他部分的电流仍维持不变，根而整个电泳系统中其他部分的电流仍维持不变，根据电导及电位梯度成反比，于是在前导离子据电导及电位梯度成反比，于是在前导离子ClCl与与慢离子甘氨酸离子之间突然形成了较高的局部电位慢离子甘氨酸离子之间突然形成了较高的局部电位梯度。处在这个局部高电位梯度区域中的血浆蛋白梯度。处在这个局部高电位梯度区域中的血浆蛋白质各成分，在高电场作用下迅速以不同的速度泳向质各成分，在高电场作用下迅速以不同的速度泳向前导前导ClCl离子区域。当到达前导离子区域。当到达前导ClCl离子区域时因不离子区域时因不缺少离子，大的电场强度减弱，离子移动速度急速缺少离子，大的电场强度减弱，离子移动速度急速减慢下来，结果在甘氨酸和减慢下来，结果在甘氨酸和ClCl离子之间的蛋白质离子之间的蛋白质样品就按其分子的大小浓缩成层。蛋白质样品浓缩样品就按其分子的大小浓缩成层。蛋白质样品浓缩了好几百倍，且蛋白质各成分...