生物技术综合实验生物技术综合实验南京师范大学生命科学学院张茵2010.3实验三、枯草芽孢杆菌碱性磷酸酶的提取和酶活测定实验目的学习盐析法提取碱性磷酸酶；学习透析法脱盐；实验材料菌种：枯草芽孢杆菌；培养基：Tris培养基；试剂：0.1MTris-HCl缓冲液（pH7.5），1MMgCl2溶液，硫酸铵固体粉末，0.1MTris-HCl缓冲液（pH9.5），40mMNPP溶液；仪器：离心机、水浴锅；其它材料：透析袋（14000Da）。实验原理渗透压冲击法破裂细胞；分级盐析法提取碱性磷酸酶；透析法脱盐；酶活测定的原理。渗透压冲击法破壁原理：碱性磷酸酶前体一般存在于外周胞质中，在跨膜分泌的过程中加工为成熟的碱性磷酸酶，故成熟的碱性磷酸酶为存在于质膜上的一种膜结合蛋白。因此本实验采用渗透压冲击法抽提碱性磷酸酶，在高渗的环境中（一定浓度的Mg2＋溶液）使目的物慢慢分泌出来。碱性磷酸酶的性质：1.碱性磷酸酶是二聚体，单体分子量约为47KDa；2.在偏酸性环境中易失活，较耐热，Mg2＋可增加其热稳定性；3.因Zn2＋是保持酶活的重要离子，故提取过程中要防止金属螯合剂；注：1、在Tris培养基中（缺磷营养胁迫下），枯草芽孢杆菌的碱性磷酸酶合成量增加，其活性也会有所增强。2、枯草芽孢杆菌发酵生产碱性磷酸酶的最佳条件是pH7.4，40度培养10h。分级盐析法原理：高浓度的中性盐溶液中存在大量的盐离子，它们能够中和蛋白质表面的电荷，使其赖以稳定的双电层受损，从而破坏了其外围的水化层；此外，大量盐离子自身的水合作用降低了自由水的浓度，从另一方面摧毁了水化层，使蛋白质相互聚集而沉淀。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐的浓度可使各种蛋白质分段产生沉淀。优点：简便、较少引起蛋白质变性；缺点：①在盐析过程中，蛋白质的溶解度剧烈下降，易产生共沉现象，故分辨率不高；②盐析后需进行脱盐步骤。影响因素：①蛋白质浓度一般控制在2％～3%；②pH值一般选择在蛋白质的等电点附近；③在高盐下，蛋白质的溶解度一般随温度的升高而降低，通常在室温下10～25℃进行盐析。透析法原理：在常压下，依靠小分子物质的扩散运动将两类分子量差别较大的物质分离开来。应用：①透析袋要留一定空间，以防膜外溶剂大量渗入袋内将袋胀裂，并因袋的膨胀引起膜孔径的变化；②透析装置常加上搅拌系统，并定期或连续更换新鲜的溶剂，以提高透析效率。透析袋：再生纤维素，具有亲水性、化学上的惰性和良好的物理性能，可再生，膜上的孔径在一定的范围内。测定酶活原理：在碱性条件下，碱性磷酸酶能够水解磷酸单酯键，本实验以对硝基酚磷酸二钠（NPP）为底物，以水解磷酸单酯键生成的对硝基酚量测定酶活力，对硝基酚的最大吸收波长为420nm。Mg2＋、Zn2＋是该酶的激活剂，而无机磷是该酶的抑制剂。酶活力单位的定义：一定条件下，在420nm处，吸光值每变化0.001定义为酶的一个活力单位。实验步骤细胞培养与收集渗透压冲击法破壁倾尽培养基，加入7mL0.1MTris-HClpH7.5缓冲液，1mL1MMgCl2溶液，轻轻吹打菌体使其悬浮于上述溶液中，37度振荡20min，5000rpm离心15min，上清液即为粗酶液。留取1mL粗酶液做酶活测定。分级盐析1.50％饱和度除杂蛋白：向其余粗酶液（约7mL）中慢慢加入研细的硫酸铵粉末至50％饱和度（边加边搅拌至硫酸铵溶解），室温下静置10min，5000rpm离心15min，弃沉淀；2.不同饱和度（60%、70％、75%、80％、90％）沉淀目的物：向上清液中继续慢慢加入研细的硫酸铵粉末至相应的饱和度（边加边搅拌至硫酸铵溶解），室温下静置10min，5000rpm离心15min，保留沉淀。透析除盐用2mL0.1MTris-HCl缓冲液溶解沉淀物，装入透析袋，两端扎紧，置于蒸馏水中透析一周，除去沉淀物中的硫酸铵。——纯酶液（下周测酶活）活化菌种种子液摇瓶发酵5000rpm15min收集菌体（每组约50mL发酵液）测定酶活（以对照组调零，测OD420nm）试剂（以下试剂均需预热）粗酶液组纯酶液组测定组1对照组1测定组2对照组2酶液（mL）0.50.51.01.02%NaOH溶液（mL）－0.5－0.50.1MTris-HCl缓冲液pH9.5（mL）0.7500.7...
