ISSN100727626CN1123870ΠQ中国生物化学与分子生物学报ChineseJournalofBiochemistryandMolecularBiology2004年2月20(1):89～94耐热碱性磷酸酶功能结构域的进一步定位郁锋,许晓风3(南京师范大学生命科学学院,南京210097)摘要为了进一步精确定位耐热碱性磷酸酶(TAP)的功能结构域和建立酶功能结构域定位的有效方法,在对TAP进行序列相容性比对及二级结构统计预测的基础上,以二级结构单元的完整性为依据对其功能结构域进行定位.TAP的功能结构域在35～476氨基酸之间,记为TAPN34C25(TAP的N端去掉34个氨基酸而C端去掉25个氨基酸),比盛小禹等定位的少15个氨基酸.克隆、表达实验结果证明了TAPN34C25的酶学活性,其最适反应温度为72℃,比TAPND27(N端去除了27个信号肽氨基酸的TAP)上升了7℃,而最高耐受温度为83℃,比TAPND27下降了16℃.实验结果表明,以二级结构预测结果进行酶功能结构域定位是一种更为精确的方法.关键词耐热碱性磷酸酶,功能结构域,序列相容性比对,二级结构统计预测中图分类号Q71FurtherLocationoftheFunctionalDomainonThermostableAlkalinePhosphataseYUFeng,XUXiao2feng3(CollegeofLifeSciences,NanjingNormalUniversity,Nanjing210097,China)AbstractTolocatethefunctionaldomainofthethermostablealkalinephosphatase(TAP)morepreciselyandtoexploreanewefficientlocationmethod,thesecondarystructurewaspredictedonNetworkProteinSequenceAnalysis(NPS@)serveranditsfunctionaldomainwasdeterminedasTAPN34C25(with34aminoacidsdeletedatNterminaland25atCterminal)accordingtotheintactnessofitstwoterminalsecondarystructures.TAPN34C25was15aminoacidresiduesshorterthanthefunctionaldomainTAPND27determinedbyShengXiao2yuetal.ThecloningandexpressionhaveprovedthatTAPN34C25didpossesstheexpectedenzymaticactivity.Itsoptimalreactiontemperaturewas72℃,with7℃higherthanTAPND27,anditshighesttolerabletemperature83℃,with16℃lowerthanTAPND27.AmoreexactTAP’sfunctionaldomainwasobtained.Theresultsshowedthattwoterminalsecondarystructure2determinedmethodwasamoreefficientforthefunctionaldomainlocationofthethermostableenzyme.Keywordsthermostablealkalinephosphatase,functionaldomain,sequencecompatiblealignment,secondarystructureconsensusprediction收稿日期:2003202219,接受日期:20032052063联系人:Tel:02523598388,E2mail:xxf@jlonline.com郁锋,男,1977年生,硕士Received:February19,2003;Accepted:May6,20033Correspondingauthor:Tel:(025)3598388,E2mail:xxf@jlonline.com自从1972年发现第一株嗜热菌以来,已经发现和分离到了70多种耐热的古细菌[1],阐明这些菌内蛋白质和酶的耐热机理不仅有重要的理论意义,而且有潜在的应用价值.一般认为酶的耐热性和结构折叠的致密性之间有很大的关系,如三级结构表面的离子对和两端肽段在结构中的锚定等[1].事实上,通常在酶蛋白的N端和C端都存在一些对于发挥特定酶活性非必需的氨基酸序列.为了判断酶两端的氨基酸序列在酶的耐热性中的作用,我们可以使用缺失突变的方法去掉这些非功能区域,比较这种改变对于酶功能和酶的耐热性的影响,从而揭示它们在酶的结构稳定性中的作用.盛小禹等从栖热菌Thermussp.FD3041中分离出一种胞内酶———耐热碱性磷酸酶(TAP)(由501个氨基酸组成,野生型的最适反应温度在70℃以上,属典型的耐热酶[2]),并对耐热碱性磷酸酶去除27个氨基酸的信号肽后的TAPND27进行了功能结构域的定位[3].他们通过依次构建TAPN8(TAPND27的N端去掉8个氨基酸)、TAPN16、TAPN25、TAPC10(TAPND27的C端去掉10个氨基酸)和TAPC30共5个缺失突变体并分别测定酶的活性确定了TAP的功能结构域为35～491个氨基酸之间.但是经过综合使用序列相容性比对和统计二级结构预测的方法,我们认为功能区域还能进一步缩小范围.通过进一步的实验验证,我们获得了更小的功能区段.这不仅使TAP酶功能区域的定位更加精确,而且对阐明非功能区氨基酸残基在酶蛋白中发挥的作用有重要意义,并为有目的地进行突变研究提供理论指导.1...
