柠檬酸对CHO细胞生长和代谢的影响VIP免费

华东理工大学学报(自然科学版)JournalofEastChinaUniversityofScienceandTechnology(NaturalScienceEdition)Vol.32No.52006205收稿日期:2005206202基金项目:国家863计划(2002AA2Z344F)作者简介:黄剑峰(19792),男,上海人,硕士,研究方向:生物化学工程。通讯联系人:张立,E2mail:lylyzhang@ecust.edu.cn文章编号:100623080(2006)0520556205柠檬酸对CHO细胞生长和代谢的影响黄剑峰,张元兴,张立(华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237)摘要:研究了重组中国仓鼠卵巢细胞(CHO)批培养过程中柠檬酸对细胞生长和代谢的影响。结果表明:柠檬酸明显抑制了细胞的生长。与对照组相比,添加12mmol�L柠檬酸的处理组细胞的葡萄糖比消耗速率(QGlc)降低了37.5%,渗透压提高了10.0%,乳酸生成量与葡萄糖消耗量的比值增加了27.0%,氨生成量与谷氨酰胺消耗量的比值也增加了。在谷氨酰胺代谢过程中,更多的谷氨酰胺经谷草转氨酶途径生成Α2酮戊二酸,参与能量代谢。柠檬酸促使细胞更多地被捕获在G1期,阻碍细胞的DNA合成,抑制细胞增殖,并促进蛋白的表达。关键词:CHO细胞;柠檬酸;代谢;细胞生长;蛋白表达中图分类号:Q953文献标识码:AInfluenceofCitrateonGrowthandMetabolismofCHOCellsHUANGJian2feng,ZHANGYuan2xing,ZHANGLi(StateKeyLaboratoryofBioreactorEngineering,EastChinaUniversityofScienceandTechnology,Shanghai200237,China)Abstract:TheinfluencesofcitrateoncellgrowthandmetabolismwereinvestigatedinbatchculturesofCHOcells.Withtheadditionofcitrate,cellgrowthisinhibitedobviously,whilethemetabolismischanged.Inbatchcultureswith12mmol�Lcitrate,thespecificglucoseconsumptionrateofCHOcellsisreducedby37.5%,andtheosmolarityincreasesby10.0%,theratiosoflactateaccumulationtoglucoseconsumptionandammoniaaccumulationtoglutamineconsumptionincrease,comparedtothoseinthemediumwithoutcitrate.Moreglutaminewasusedforenergymetabolismthroughaspartateaminotransfer2asepathway.CHOcellscouldbecapturedinG1phasebycitrate,whichcouldblockDNAsynthesis,inhibitcellgrowthandinduceproteinexpression.Keywords:CHOcells;citrate;metabolism;cellgrowth;proteinexpression柠檬酸是三羧酸循环中重要的中间产物,连接着糖酵解和三羧酸循环,它对糖和脂肪酸代谢有着极为重要的意义。它在糖代谢过程中产生异柠檬酸,抑制磷酸果糖激酶和丙酮酸脱氢酶的活性[1～2]。大部分柠檬酸离开三羧酸循环,作为线粒体外乙酰辅酶A合成的碳源[3]和乙酰辅酶A羧化酶的激活剂[4～5],用于脂肪酸的合成。柠檬酸是能量代谢的产物,当代谢不均衡时,其浓度会明显上升。许多因素都会影响柠檬酸代谢,包括碳源的种类和浓度、氮和磷酸盐浓度、通气状况、微量元素和有机体产物的组成等。细胞的代谢途径主要由细胞株本身的性质及生理状态决定。研究柠檬酸对动物细胞生长及代谢的影响对于培养过程的优化具有重要意义。许多研究认为,使细胞捕获在特定的细胞周期是提高重组细胞蛋白生产的一种有效手段。Jenkins等[6]通过降低655细胞培养温度,使CHO细胞捕获在G1期而提高了重组蛋白质的生产。Watanabe等[7]对NSO细胞研究发现,添加IPTG(异丙基2Β2硫代半乳糖苷)后更多的细胞捕获在G1期,使蛋白表达量提高了4倍以上。Carvalhal等[8]发现,细胞周期依赖性激酶抑制因子p27过量表达时,会明显抑制处于G1期的细胞生长,并使蛋白高效表达。Aggeler等[9]用同步化的方法研究发现,分泌型溶纤酶原激活剂仅仅在G2�M期表达,而细胞依附型溶纤酶原激活剂大部分表达在G1期和S期。一般认为,外源蛋白质的生产在特定的表达系统中是与特定细胞周期有紧密关系的。本文通过CHO细胞在不同柠檬酸浓度下的培养,研究了不同柠檬酸浓度对细胞生长、代谢及蛋白表达的影响。1材料与方法1.1实验材料细胞为带有外源谷氨酰胺合成酶(Glutaminesynthase,GS)基因,表达外源蛋白的重组CHO细胞。培养基为含有100g�L新生牛血清(NCS)(杭州四季青生物工程材料有限公司)的DMEM�F12(体积比1∶1)培养基(Sigma,USA)。1.2细胞培养在75cm2的方瓶中加入培养基10mL,...