脱氧胆酸钠(SDC)促进的蛋白质酶解与鉴定VIP免费

http://www.paper.edu.cn-1-脱氧胆酸钠(SDC)促进的蛋白质酶解与鉴定1林勇，周健，毕登，陈平，王贤纯＊，梁宋平＊湖南师范大学生命科学学院，长沙（410081）E-mail：liangsp@hunnu.edu.cn，wang_xianchun@263.net摘要：在蛋白质组学研究中，变性剂（如SDS和尿素）已被广泛应用以增强蛋白质的溶解性和提高蛋白质鉴定效率。但是，大多数的变性剂在一定程度上抑制酶活性和影响后续质谱分析。在本文中，脱氧胆酸钠（SDC）作为一种与胰蛋白酶和质谱分析兼容的变性剂被用于蛋白质的溶解和分析。不同SDC浓度下胰蛋白酶活性的检测表明，1％的SDC浓度对酶活性无明显影响;在10%SDC浓度下，该酶的活性仍保持70%。对比研究结果显示，肌红蛋白在1%SDC的溶液中短时间(30min)内即可发生显著的降解,而在NH4HCO3和尿素溶液中肌红蛋白无明显变化。利用标准蛋白混合物进行基于不同酶解条件的蛋白质鉴定实验,证明1%SDC能显著提高蛋白质的鉴定效果。SDC是一种酸性不溶试剂，可以酸化后离心除去，从而不会影响后续的质谱分析。关键词：变性剂；脱氧胆酸钠；酶活性；蛋白质；溶解性；鉴定中图分类号：Q511.引言近年来，液相色谱-串联质谱和基质辅助激光解吸飞行时间质谱已经成为在蛋白质组学基础上研究生物学问题的两个主要工具[1-4]。进行蛋白质鉴定时，蛋白质需首先被酶解成肽段混合物，然后进行质谱分析,蛋白质的酶解效率直接影响着蛋白的鉴定结果。因此,蛋白质的酶解不仅仅是起始步骤，而且是相当重要的一步。众所周知，许多蛋白质具有紧凑的结构和较强的疏水性，从而影响了它们的溶解性。有效的酶解首先需要蛋白质的溶解和变性。为了解决这个问题，人们提出了很多方法，例如热变性[5]，化学变性（去垢剂或有机溶剂）[6,7]，微波辐射[8]等。在样品的处理过程中使用变性剂促进难溶性蛋白质的溶解是广泛采用的方法。SDS和尿素是两种最常用的变性试剂。SDS是一种离子型的去垢剂，能够相当有效的溶解和变性蛋白，但是它的最大的缺点就是明显影响酶活性和干扰肽段的色谱分离及质谱鉴定。尿素是一种离液剂，也能很好的溶解和变性蛋白。由于较小地影响质谱的分析，因此应用很广泛。但它的一个缺点就是会导致一些蛋白的修饰如N-末端和赖氨酸的氨甲基化，从而影响蛋白的鉴定[9]。因此，筛选和寻找能在较高浓度下使用，既能有效溶解蛋白质又不明显干扰酶活性，同时对质谱鉴定影响很小的变性剂，是提高蛋白质（尤其是一些疏水性强的蛋白质）鉴定效率的重要途径。我们在研究中发现，脱氧胆酸钠（SDC）不仅可以增强蛋白质的溶解性，而且即使在较高的浓度下使用对胰蛋白酶活性影响也很小，同时可以酸化后离心除去，从而可以促进蛋白质的酶解和鉴定。本研究中，我们通过与碳酸氢铵和尿素的一系列比较实验，证实了SDC辅助液相酶解是一种简单、快速、有效且与质谱分析兼容的方法，能有效促进蛋白质的酶解和提高蛋白质的鉴定效率。2.材料和方法2.1材料肌红蛋白，溶菌酶,酪蛋白，乳球蛋白，碳酸酐酶，脱氧胆酸钠（SDC），胰蛋白酶，1本课题得到教育部高等学校博士学科点专项科研基金（20040542002，20050542003）和国家科技部重大基础研究前期研究专项基金（2004CCA00300）的资助。http://www.paper.edu.cn-2-DTT，IAA，碳酸氢铵，三氟乙酸，HEPES，PMSF购买于Sigma公司；尿素来自于Amresco公司；色谱纯乙腈是上海化学试剂公司产品；苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）购买于上海生物研究所东风生化技术公司；其他的都是国内色谱纯试剂。2.2SDC对胰蛋白酶活性影响的检测称取适量的苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE），用５０mM的碳酸氢铵缓冲液溶解．２５℃水浴１０min，以溶解缓冲液作空白，在２５３nm处测定吸收度，以５０mM的碳酸氢铵缓冲液稀释底物，使其吸光值在０.５７５～０.５８５之间，备用。底物溶液被配成含有不同浓度的SDC的溶液后，加入适当的酶液，摇匀，在２５３nm波长处每隔３０s读取吸光值，检测５min。分别以时间和光吸收值为横坐标和纵坐标作图，观察酶活性的变化[10]。2.3肌红蛋白的酶解及色谱分析Myoglobin（100µg）被分别溶解在５０mM的碳酸氢铵（pH7.8），8M尿素（酶解时稀释到２M）和１％SDC中；它们的体积均...