第一节生物成分的分离与测定技术[学习目标]1.掌握分离与测定生物成分中蛋白质的技术。(难点)2.掌握采用醋酸纤维薄膜电泳的方法分离并纯化蛋白质。(重点)3.掌握采用水蒸气蒸馏法和脂溶性有机溶剂提取法提取脂肪成分。(重难点)知识点一|分离与测定生物成分中的蛋白质1．抽提液的选择2．分离蛋白质的方法(1)离心沉降法：通过控制离心速率，使分子大小、密度不同的蛋白质发生沉降分层。(2)薄膜透析法：利用蛋白质分子不能透过半透膜的特性，使蛋白质与小分子化合物分离开的纯化蛋白质的方法。(3)凝胶色谱法①概念：根据蛋白质分子的大小对其进行有效分离的方法。②凝胶③原理是否进入凝胶颗粒移动途径路程移动速度洗脱次序大分子蛋白质不能进入凝胶颗粒间隙较短较快先洗脱出来小分子蛋白质可以进入凝胶颗粒内部较长较慢后洗脱出来(4)电泳法：将所带电荷的数量和性质不同的蛋白质从混合样品中分离并纯化出来。3．血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳配制试剂―→准备器材―→架滤纸桥―→浸泡薄膜―→细心点样―→平悬薄膜―→实施电泳―→染色―→漂洗―→脱色。[合作探讨]探讨1：在抽提液中加入蛋白酶抑制剂的目的是什么？提示：防止提取过程中蛋白质被蛋白酶分解。探讨2：在电泳过程中，影响泳动速度的因素有哪些？提示：带电颗粒的性质，即颗粒的大小、形状和所带电荷的多少；此外还有电场强度、溶液的pH等因素。探讨3：洗涤红细胞时能否用蒸馏水代替生理盐水？提示：不能。生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定而不至于破裂，在未洗净血浆中的杂质蛋白前，红细胞如果提前破裂，就可能使血红蛋白质与杂质血浆蛋白混在一起加大了分离的难度。[思维升华]1．蛋白质的分离方法(1)薄膜透析法①原理：蛋白质水溶液具有亲水胶体溶液性质，不能透过半透膜。②目的：去除小分子化合物杂质，如无机盐、单糖、二糖、氨基酸等。③常用的半透膜：肠衣、玻璃纸等。④步骤：将待纯化的蛋白质溶液装入透析袋内，再把透析袋放入透析液中即可。(2)离心沉降法①原理：在离心力的作用下，分子大小、密度不同的分子沉降速度不同，从而被分离。②目的：使分子大小、密度不同的不同种类的蛋白质彼此分离。(3)电泳①概念：带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动的现象。②原理：不同的物质所带电荷不同，颗粒的大小、形状不同，因此，在电场中的泳动速度不同。③影响泳动速度的因素：带电颗粒的性质，即颗粒的大小、形状和所带电荷的多少；此外还有电场强度、溶液的pH等因素。④泳动规律：带电颗粒直径越小、越接近于球形，所带净电荷越多，则在电场中的泳动速度越快；反之，则越慢。⑤常用方法：支持物电泳。⑥支持物：滤纸、醋酸纤维薄膜、大分子凝胶等。2．血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳(1)特点①电泳后区带界限清晰。②通电时间较短(60～90min)。③它对各种蛋白质都几乎完全不吸附，因此无拖尾现象。④对染料也没有吸附，因此不结合的染料能完全洗掉，无样品处几乎完全无色。(2)关键步骤及其技术要求：点样是本实验的关键步骤。点样前，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免引起样品扩散；但不宜太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起始参差不齐，影响分离效果。(3)结果及其分析①结果：血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳图谱示意图②结果分析：从电泳图谱示意图中可以看出：a．血清蛋白主要包括五种蛋白质，且含量最多的是清蛋白，其他依次是：γ球蛋白＞α1球蛋白＞α2球蛋白＞β球蛋白。b．由五种蛋白质所处的位置可判断出它们均带负电荷，四种球蛋白在电场中的泳动速度由快到慢依次为α1球蛋白＞α2球蛋白＞β球蛋白＞γ球蛋白。3.凝胶色谱法分离血红蛋白(1)样品处理：以低速短时间离心分离红细胞，获得被洗净的红细胞。(2)血红蛋白的释放、分离和透析①用蒸馏水和甲苯破裂红细胞，释放出血红蛋白，得到混合液。②离心混合液，过滤除去沉淀层，用分液漏斗分离出红色透明液体。③用磷酸缓冲液透析红色透明液体12h。(3)凝胶的制备：用蒸馏水溶胀交联葡萄糖凝胶，制成凝胶悬浮液。(4)色谱柱的装填①垂直固定洗净的层析柱选择有薄膜的端为下口。②打开下端的乳胶管开口，将搅动均匀的凝胶悬浮液沿柱的内壁缓缓一...
