单细胞凝胶电泳技术的试验步骤试剂及材料:1)0.01MPBSpH7.3:8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4,溶于800ml蒸馏水中,用HCl调节溶液的pH值至7.3,最后加蒸馏水定容至1L即可。保存存于室温或4℃冰箱中。2)0.8%正常熔点凝胶(PBS配制)3)0.6%低熔点凝胶(PBS配制)4)毛玻璃片5)盖玻片6)碱性裂解液(2.5mol/LNaCl;100mmol/LNa2EDTA;10mmol/LTris;1%肌氨酸钠),临用前加10%DNMSO,1%TritonX-1007)电泳缓冲液(1mmol/LNa2EDTA;300mmol/LNaOH;Tris.Cl,pH7.5)8)EB(2ug/ml)步骤:1.制备第一层胶:100ml0.8%正常熔点胶,加盖盖玻片,4℃固化10min;2.制备第二层胶:轻轻地去除盖玻片,在第一层胶上滴加75ul含1×10000个细胞的0.6%低熔点胶(cell与凝胶比例为1:5),加盖盖玻片,4℃固化10min;3.裂解:去掉盖玻片,将凝胶浸入冰冷的碱性裂解液内(临用前加10%DMAO,1%TritonX-100),4℃裂解1h;4.取出玻片,用PBS缓冲液漂洗3次后置于水平电泳槽内,加入pH13的电泳缓冲液(没过玻片2-3min),放置20min(黑闭)。5.电泳:电压20V,300mA,30min6.取出玻片,用PBS或Tris.Cl,pH7.5漂洗3次,每次3min;或双蒸水漂洗2次,每次5~15min,7.染色:胶上滴加3ulEB,加盖盖玻片,24h检测。或者4℃,潮湿,闭光的条件下保有胶片,观察时再染色,镜检。1.2.5改良彗星试验操作步骤为节省实验时间,本研究将铺三层胶法改为铺一层胶法,同时在中和及染色等步骤进行了改良,具体操作如下:将已染毒的淋巴细胞悬液与40℃的1%低溶点琼脂糖等浓度混匀后,取70μl混合液直接滴加在磨毛玻片上,加盖玻片,4℃冷凝,20min后揭盖片;4℃于碱性裂解液中裂解1h;解旋20min;4℃电泳(25V,300mA)30min;中和5min;加碘化丙啶,暗处染色10min,加盖片;于莹光显微镜下镜检,照像。四、操作步骤1.各种细胞用冰冷的PBS洗一次,离心收集,用PBS重悬,密度为1×104-5个/ml。2.铺胶:下述各浓度琼脂糖凝胶均用PBS配制。3.第1层凝胶的制备:将加热熔解的正常熔点琼脂糖(NMA),冷至45-60℃,取适量铺于载玻片CometSlide上,再置4℃下10min使NMA凝固。也可以先铺胶,晾干后无尘存放,1周内使用(据经验,此法较优)。4.第2层凝胶的制备:低熔点琼脂糖LMA在60-70℃水浴加热至少20min使之完全溶化,冷至37℃(可以放置于细胞培养箱中或水浴箱冷却至37℃,低熔点琼脂糖LMA在37℃可维持3小时)。将20μL细胞(约104个)和75μL的LMA混合均匀。然后,迅速将适量含细胞的LMA滴到第1层琼脂糖上,立即盖上另一干净盖玻片,置4℃10min使第2层LMA凝固。注意,使用盖玻片的目的是使琼脂糖平整显微镜下方便观察,经验丰富者,可以不用,也可以达到好效果。5.第3层凝胶的铺制::第2层LMA凝固后,在室温下小心移去盖玻片,重复第二层的步骤。(此步可以不作,一般铺一层细胞就足够)6.细胞裂解:移去盖玻片,将玻片置于平皿中,轻轻加入预冷的新鲜配置的细胞裂解混合液(配制见试剂使用说明的1,2)。4℃下裂解1-3h。取出载玻片用蒸馏水漂洗2次,要求动作轻柔,以免琼脂糖脱落。7.DNA碱解旋:将载玻片置于水平电泳槽。倒入新配制的电泳缓冲液约覆过载玻片胶面0.25cm左右,室温放置20min,以便使DNA在碱性条件下解螺旋和产生碱易变性区段,使DNA断链在电场中易于迁移。8.细胞电泳:电压15-25V,电压、电流可用改变缓冲液面高低来调节,电泳时间为10-20min。建议预实验,摸索最佳的电压、电流及时间。9.电泳后将载玻片置于平皿内。加入蒸馏水,漂洗2次,每次5min,弃去蒸馏水,每载玻片加2-3滴染色剂,盖上盖玻片(也可以不盖上),避光染色10min。盖上盖玻片的目的是可以隔日分析,或便于操作。10.观察、拍照和分析:荧光显微镜515-560nm(绿光)波长的激发光,可清楚地观察到核DNA和迁移的DNA(即慧星尾)。色泽和图像十分精美,每个样本随机选择20-100个细胞,图片保存后,用相应的软件分析结果。。单细胞凝胶电泳(彗星实验)操作步骤1.各种细胞用冰冷的PBS洗1~2次,离心收集,用PBS0.3ml重悬,密度为1×105-6个/ml。2.铺胶:下述各浓度琼脂糖凝胶均用PBS配制。3.第1层凝胶的制备:用微波炉加热溶解正常熔点琼脂...