几乎所有的生化实验都必须用到缓冲液，这是因为我们所处理的材料，生物分子或细胞胞器，在自然的环境中都受到严格恒定的pH控制，因此当我们将这些生物巨分子抽提出来后若能将之保存于正常生理pH6~8的条件下，可使这些材料维持最佳稳定性。此外有许多的酵素反应都涉及H+的释放，若无缓冲液维持恒定的酸碱度，许多生化反应将无法顺利进行。虽然大部分的生化实验所需的环境在pH6~8之间，但是仍有少数状况需要极端的pH环境，图4-1列出了在生化实验常用的缓冲液及其适用之pH。以下我们将介绍一些生化实验常用的缓冲溶液。4.1.3Phosphatebuffers磷酸是最常使用的缓冲溶液之一，在pH6.5~7.5之间具有很好的缓冲能力，加上磷酸本身就是细胞及许多生物液的成分之一，因此更能提供一种较“天然”的环境。使用磷酸钠或磷酸钾都具有很高的溶解度，十分容易配制。但磷酸缓冲液有以下缺点：(1)会与一些有生物活性的离子如钙离子、镁离子产生沈淀(2)对高等动物细胞有少许毒性(3)会抑制部分生物反应。4.1.4TrisbufferTris[tris(hydroxymethyl)aminomethane]可算是生化实验中最常使用的缓冲液，尤其在分子生物实验中最常使用。因为它有极佳的缓冲能力、毒性低、对生物反应的干扰极低，而且纯度很高。Tris本身是一级胺但是它并不会沈淀钙离子，其pKa为8因此在pH7.5~8.5有良好的缓冲能力，然而在pH7.0时通常只能配成低浓度(0.01M)此时的缓冲效果就不怎么理想了！Tris缓冲液具有以下的缺点：(1)浓度会影响其pH，通常每稀释10倍，pH会下降0.1pHunit(2)会干扰某些pH电极(3)pH受温度影响甚大，在摄氏25~5℃间每下降1℃，pH下降0.03pHunit。因此改进的方式包括了：(1)稀释后重新校正其pH值(2)使用特殊不受Tris干扰的电极(3)在所欲使用的温度下调配所需的缓冲液。4.1.5CarboxylicAcidBuffers这类缓冲液包括了醋酸盐(acetate)、甲酸盐(formate)、柠檬酸盐(citrate)以及琥珀酸盐(succinate)等等，这类缓冲液提供了pH3~6异于一般缓冲液的缓冲区间，但由于它们都是天然代谢产物，因此有可能会干扰某些生物反应。此外citrate与succinate也会与一些具生物活性的金属离子(Fe3+,Zn2+,Mg2+,etc.)结合，产生沈淀。其中醋酸与甲酸都具有挥发性，在应用上可直接以真空干燥的方法去除。4.1.6BorateBufferandGlycineBufferboratebuffer的缓冲区间在pH8.7~9.7，glycinebuffer则为pH9.5~10.1都属于较碱性的缓冲液。较值得注意的是某些噬菌体(bacteriophage)能稳定保存在boratebuffer中。而glycine本身是代谢产物，有可能会干扰部分生物反应，另外，两者都不具有UV吸收能力，且不与二价正离子作用。4.1.7Good’sbuffer(ZwitterionicBuffers)在1960年代中期NormanGood鉴于一般的缓冲液系统并不适合生化实验所使用，因此研究了许多合成的zwitterionicbuffer，找到许多适合生化实验的缓冲液系统，它们都具有以下特质：1.pKa在6~8之间。2.在水溶液中有高溶解度。3.salteffect很小。4.不易被运送通过细胞膜。5.不易受温度、离子组成、浓度等因素影响解离度。6.不会与金属离子形成错合物，或错合物不沈淀、不干扰生物活性。7.化学性质稳定。8.高纯度。表4-1列出了常用的Good’sbuffer及其特性。部分buffer如Tris、HEPES和PIPES在不同的反应条件下可能会有freeradical产生，因此若对氧化还原敏感的实验要选择不会产生自由基的MES或MOPS。Good’sbuffers实在可称得上是goodbuffer了，但它唯一的缺点就是，贵！表4-1：Good'sbuffers及其缓冲区间pKaUsefulpH(20℃)Bufferrange6.15MES5.8~6.56.62ADA6.2~7.26.80PIPES6.4~7.26.88ACES6.4~7.47.15BES6.6~7.67.20MOPS6.5~7.97.50TES7.0~8.07.55HEPES7.0~8.08.00EPPS7.6~8.68.15Tricine7.6~8.88.35Bicine7.8~8.89.55CHES9.0~10.110.40CAPS9.7~11.14.2酸碱度计的原理与应用一般实验时pH值的计算通常是将玻璃电极浸入溶液中，再由酸碱度计的主机面板上读取数值。而在每一次的测定时均需要两种电极，一个是用以感知氢离子浓度的电极(pH-dependent)，另一个适用以当参考的氯化亚汞电极(pH-independent)，此二电极在溶液中的电位差可由下列方程式(4-5)以电压来计算:V为电极电压差Econstant为参考电...
