紫杉醇发酵生产工艺VIP免费

微生物发酵生产紫杉醇产品介绍及社会价值：紫杉醇是一种二萜类衍生物，是当前公认的广谱、活性强的抗癌药物之一?。紫杉醇最早是wanj等于1971年从短枝红豆杉(7Ikusbreviifolia)树皮中分离得到的。随后，schiff等证实紫杉醇具有独特的抗癌机制。随着紫杉醇的临床应用，对其研究也逐渐深入，其主要抗癌机制为抑制肿瘤细胞的微管(Microtllbules)合成，以阻断细胞分裂，致使肿瘤体积逐渐缩小；紫杉醇还可诱导细胞凋亡，另外还有类似脂多糖(IPS)的作用，可调节机体的免疫功能。目前国际市场上的紫杉醇仍依靠从红豆杉树皮提取及半合成，迄今为止尚未见有第三种形式形成大规模工业化生产的报道。紫杉醇的工业生产受到了原料和技术两方面的制约，短期内难以突破。为了解决红豆杉资源短缺与紫杉醇需求量的日益增加的矛盾，人们对生产紫杉醇进行了多方面的研究，包括化学全合成、红豆杉细胞培养及微生物发酵。微生物发酵法生产紫杉醇因具有明显优势，其研究和开发越来越受到国内外研究学者的广泛关注。这里提出一种运用基因工程，代谢工程，发酵工程结合的方法生产紫杉醇，该法首先将杉醇纯合成基因克隆至大肠杆菌，让其高产紫杉二烯，再把它流加至高产紫杉醇酵母的发酵罐中，运用代谢工程手段生产紫杉醇。创新点：运用克隆方法，将合成紫杉二烯的代谢过程酶的结构基因，以及调控系列克隆至大肠杆菌，让其表达，此过程刚被ParayilKumaranAjikumar及其同事实现，而运用代谢工程手段让高产紫杉醇酵母利用紫杉二烯这个前体高产紫杉醇，这是没尝试但可行的。国内外研究：1、分离菌种：最早stierle和strobel等在短叶红豆杉的枝条上分离到一种内生真菌，能够产生紫杉醇，定名为安德列亚霉。此后，各国学者纷纷开展产紫杉醇内生真菌的分离工作，陆续从西藏红豆杉、云南红豆杉、东北红豆杉、欧洲红豆杉、中国红豆杉中分离到产紫杉醇的内生真菌，其宿主植物几乎涉及红豆杉属的各个种。周东坡领导的课题组从百年以上的东北红豆杉的枝条与树皮中分离到3株可产紫杉醇的内生真菌，发酵液中紫杉醇的产量可达51．06μg/L～125．70μg／L。王建锋等也从南方红豆杉皮层中分离到一株瘤座孢菌，发酵产物分析表明可产紫杉醇，产量为185．4μg/L。2、菌种改良：诱变：HQD33（周东坡分离）经过紫外线、EMS、60co、NTG等诱变剂顺序诱变得到高产突变株NCEU一1，其紫杉醇产量到达314．07μg/L。原生质体融合：赵凯等人发现最佳的诱变条件为30w紫外灯、30cm距离、照射50s；UV+Licl复合诱变、照射时间40s。3、构建工程菌：紫杉醇的生物合成途径为最近ParayilKumaranAjikumar及其同事通过平衡数种细菌和植物的酶来利用大肠杆菌发酵产物紫杉二烯，其产量为1g/L.工艺流程：一、产紫杉二烯工程菌构建：基因文库的构建：取欧洲紫杉醇提取染色体目标基因的获得：取得合成紫杉二烯酶的结构基因及调控系列扩增质粒的构建：将紫杉二烯酶的结构基因及调控系列连接到质粒上二、大肠杆菌发酵生产紫杉二烯：培养基原料培养基配制培养基灭菌工程菌摇瓶种子罐生产罐培养液细胞分离三、通过基因工程手段调整高产紫杉醇酵母产紫杉醇的途径，使它能利用紫杉二烯高效合成紫杉醇，构建工程菌四、酵母发酵生产紫杉醇培养基原料培养基配制工程菌摇瓶种子罐生产罐培养液细胞分离无细胞上清液产品抽提产品精制产品包装废水处理培养基原料：大肠杆菌发酵液质量标准主要活性成分：5β，20-环氧-1，2α，4，7β，10β，13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4，10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13－[（2’R，3’S）-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯]。按干燥品计算，含C47H51NO14应为98.0－102.0%。性状：白色结晶性粉末，无臭，无味。在甲醇、乙醇或氯仿中溶解，在乙醚中微溶，在水中几乎不溶。比旋度取本品，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中含3mg的溶液，重组DNA导入宿主细胞工程菌的培养与目标产物分离表达质粒的构建与诱导表达扩增质粒的构建基因文库的构建目的基因的获得载体质粒的制备依法测定，比旋度为-48°至-56°。鉴别：（1）取与紫杉醇对照品，分别加甲醇制成每1ml中的含1.0mg的溶液，照薄层色谱法（试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅...