植物总植物总DNADNA的提取的提取及琼脂糖凝胶电泳检测及琼脂糖凝胶电泳检测植物基因组DNA的提取琼脂糖凝胶电泳检测一、实验目的学习提取和纯化高等植物总DNA的方法，理解其原理。脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)与蛋白质结合在一起以核蛋白（DNP）的形式存在。在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出来。植物总DNA包括细胞核DNA和细胞核外DNA,前者存在于细胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性复制活性的细胞器内，例如线粒体DNA(mtDNA)和叶绿体DNA(ctDNA)。二、实验原理细胞破碎抽提去蛋白质沉淀核酸基本过程①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；②化学试剂法：用SDS处理细胞；③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。细胞破碎SDS法SDS是有效的阴离子去垢剂,细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,SDS能够破坏这种价键。CTAB法CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。DNA提取蛋白质常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（24：1）抽提。RNA常选用RNase消化，或是用LiCl来消除大分子的RNA。酚类物质提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。DNA纯化（去杂质）实验材料植物叶片(去叶脉)试剂2×CTAB抽提液（CTAB、Tris-HCL、EDTA、Nacl）TE缓冲液(pH=8.0)氯仿：异戊醇(24:1)巯基乙醇异丙醇70%乙醇三、材料与试剂①离心机②水浴锅③研钵④微量移液器仪器用具移液器－量程的选择1．取2g清洗凉干的植物幼嫩叶片于研钵中，加入液氮，迅速研磨。将2×CTAB抽提液与2ml巯基乙醇在提取前混合后于65℃水浴中加热30分钟。2．将0.5mL研磨液转入1.5mL离心管中，加入1mlCTAB提取液，置于65℃水浴中保温30min，其间颠倒混匀2－3次。破碎细胞3.加入等体积氯仿：异戊醇（24:1）混合液，充分颠倒混匀20分钟，防止成团。8000r/min，离心5min，取上清。抽提去蛋白4．将上清液移入新的1.5mL离心管内，加等体积异丙醇（预冷）。颠倒混匀，可见DNA絮状沉淀。沉淀核酸5．8000r/min，离心1min，倒掉上清液，将离心管倒置干燥。将沉淀回溶于无菌水或TE缓冲液待测。四、操作步骤1)选取新鲜材料，研磨迅速彻底，研磨好的材料应与CTAB抽提液充分混匀；2)若提取产物有颜色，可能是材料中含有较多的多酚类物质，添加巯基乙醇（2－5％），尽可能选取幼嫩的材料；3）收集CTAB与核酸形成的复合物时不要离心过度，否则沉淀再溶解难；4）为了获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过程中必须采用温和的条件，避免过酸过碱、剧烈地搅拌，防止热变性，同时还要避免核酸降解酶类的降解。五、注意事项六、作业为了获得高质量的植物总DNA，在分离提取过程中应注意那些问题？琼脂糖凝胶电泳检测DNA一、实验目的学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定电场强度下，DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数成反比。二、实验原理琼脂糖是一种线性多糖聚合物。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。琼脂糖浓度琼脂糖浓度(%)(%)线型线型DNADNA分子的分离范围分子的分离范围(Kb)(Kb)0.30.355～～60600.60.611～～20200.70.70.80.8～～10100.90.90.50.5～～771.21.20.90.9～～661.51.50.20.2～～3312.012.00.10.1～～22三、实验仪器和试剂仪器–电泳仪–电泳槽–灌胶模具等–Tris-硼酸（TBE）Tris-乙酸（TAE）Tris-磷酸（TPE）常用电泳缓冲液电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。作用：①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。③使样品呈色，使加样操作更方便。上样缓冲液溴化乙锭（EB）是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般>5ng。EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。GoldViewTM:是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染...
