循环肿瘤DNA(ctDNA)检测策略及临床意义刘小龙，博士、研究员福建医科大学孟超肝胆医院，中国科学院海西研究院转化医学研究中心2015.06.12肿瘤诊疗的困境：早期诊断困难，错过最佳治疗时机；易复发转移，预后差；放化疗易产生耐受；缺乏有效的治疗靶点等。早诊早治，实时监控、靶向用药及个体化诊疗是提高肿瘤远期生存率、降低死亡率的关键。肿瘤诊断方法血清标志物：蛋白类（癌胚抗原，糖类抗原，甲胎蛋白等），核酸类（microRNA,LncRNA）影像学诊断(超声，CT，MRI，PET，PET-CT)循环肿瘤细胞（circulatingtumorcell,CTC）循环肿瘤DNA（circulatingtumorDNA，ctDNA）循环肿瘤DNA(ctDNA)人体血液循环系统中不断流动的携带一定特征（包括突变，缺少，插入，重排，拷贝数异常，甲基化等）来自肿瘤基因组的DNA片段；来源：1、来自于坏死的肿瘤细胞；2、来自于凋亡的肿瘤细胞；3、循环肿瘤细胞；4、来自于肿瘤细胞分泌的外排体；含量低，约占整个循环DNA的1%，甚至只有0.01%。ctDNA发展简史1948年首次发现人体血液中存在着循环DNA，癌症患者的循环肿瘤DNA则发现于1977年。1994年发现这些DNA含有癌症的标志性突变，证明其来自于肿瘤。鉴于肿瘤DNA会流入血液，香港中文大学的卢煜明（DennisLo）教授推测胎儿DNA应该也能进入血液。1997年证明孕妇血液中携带着男性胎儿的Y染色体。该发现允许医生们在怀孕初期通过无创方式检测胎儿的性别，甚至筛查唐氏综合症等发育疾病。这是产前诊断领域的一次革命。NatureReviewsCancer11,426-437(June2011)|doi:10.1038/nrc3066Cell-freenucleicacidsasbiomarkersincancerpatientsctDNA发展简史研究热点近10年ctDNA相关发表文章数（pubmed数据库）NEJM：4篇PNAS：7篇JAMA：1篇SciTranslMed：6篇Cancerresearch:12篇ClinCancerRes:28篇ctDNA优势无创、无损、实时、多次；当不能获得肿瘤组织信息时，可以开展“液体活检”；假阳性率低，灵敏度高，准确度高，可用于肿瘤的早期诊断；能够对肿瘤的演化和适应性改变进行监控；能够对肿瘤病人的治疗效果进行实时监控（尤其在追踪肿瘤转归、转移和复发等方面），并进行个性化的治疗方案指导（如个性化靶向药物用药，个性化化疗等）。一类具备广泛应用前景的肿瘤标志物，可无创的用于肿瘤早期诊断、发展过程监测、预后判断、以及个性化用药指导。ctDNA检测技术敏感度已知突变位点检测（突变率<2%）数字PCRBEAMing技术标记扩增深度测序（TAM-Seq）癌症个体化深度测序(CAPP-Seq)未知突变位点检测（突变率>2%）全基因组测序全外显子测序RNA末端平行分析法全基因组甲基化测序数字PCR将一个标准PCR反应分配到大量微小的反应器中，在每个反应器中包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)，实现“单分子模板PCR扩增”，扩增结束后，通过阳性反应器的数目“数出”目标序列的拷贝数。阴性微滴比例推算起始靶分子的绝对量泊松分布一个待分析的PCR反应体系成千上万个独立的PCR反应体系:靶标分子:有限稀释●:阳性微滴（1）○:阴性微滴（0）泊松分布PCR扩增优点：可绝对定量，灵敏度可达单个核酸分子，检测限低至0.001%；缺点：只能检测已知的突变位点，通量低；利用数字PCR监测肺癌病人中第一次服用埃罗替尼抗肿瘤药物后的血浆EGFR突变情况。经过治疗后，所有病人的EGFR突变都出现下降，其中有8个病人突变完全消失。有6个病人的EGFR突变在后续出现上升，提前揭示疾病进展。另外3个病人的EGFR突变没有变化，病情无明显进展。数字PCR可以用于评估和监测血浆中ctDNA的特异突变结合数字PCR与流式技术，利用特异性PCR引物扩增目标突变区后，与磁珠（磁珠上固定有特异的PCR引物）混合进行油包水单分子扩增反应。反乳化作用后，利用不同颜色的荧光探针结合磁珠上的PCR产物，发出红色或绿色荧光。使用流式细胞仪分析磁珠颜色来确定突变情况。BEAMing技术利用肿瘤组织进行sanger测序定义肿瘤组织的基因突变；再利用Beaming技术检测18例癌症病人中192份血浆样本中ctDNA的突变情况，检测灵敏度可达到0.005%。术前:13.4%术后:0.015%术后(48天):0.11%术后(244天):0...
