2025年荧光定量PCR法原理汇总VIP免费

我们前面比较具体地介绍了荧光染料法做定量PCR的有关技术和产品，显然，作为定量PCR的早期阶段的荧光染料法还是有局限性的，例如，由于染料不能分辨特异性PCR产物和引物二聚体等非特异产物，也不能分辨不同探针，因此检测的特异性始终不如后来出现的探针法；需要在PCR后进行熔链曲线分析；也不能做多重PCR检测（Multiplex）。上个世纪90年代原美国PerkinElmer(PE)公司开发出了Taqman荧光探针定量技术，将定量PCR带入了更广阔的应用空间。Taqman探针法的出现是定量PCR技术的重要里程碑，之后在此基础上发展出了杂交探针法，以及荧光引物法，是对探针法的不停改善和简化。如果但愿全方面掌握定量PCR技术的研究人员就不能错过这些定量检测技术。要提到荧光探针或者荧光引物，有一种基础概念需要首先明确，那就是荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)：一对适宜的荧光物质能够构成一种能量供体(donor)和能量受体(acceptor)对,其中供体的发射光谱与受体的吸取光谱重叠，当它们在空间上互相靠近到一定距离(1—10nm)时，激发供体而产生的荧光能量正好被附近的受体吸取，使得供体发射的荧光强度衰减，受体荧光分子的荧光强度增强。能量传递的效率和供体的发射光谱与受体的吸取光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等有关。定量PCR所涉及的荧光探针和荧光引物的检测都这个FRET原理有关。实时荧光PCR中另一种很重要的概念，即Ct值.C代表循环(Cycle)，T代表阈值(Threshold).Ct值是指每个反映管内的荧光信号达成设定的阈值时所经历的循环数.。普通取PCR反映的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省设立是3-15个循环的荧光信号的原则偏差的10倍。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。运用已知起始拷贝数的原则品可做出原则曲线.因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从原则曲线上计算出该样品的起始拷贝数。一：水解探针法TaqMan技术原理：除了一对特异性引物，TaqMan探针法增加一条和模版互补的基因特异性探针（普通20—30bp），探针上5'端和3'端分别标记了一种报告荧光基团（供体）和一种淬灭荧光基团（受体），在反映初始（探针完整）时系统激发供体而产生的荧光信号被临近的淬灭基团吸取，因此此时检测不到供体荧光信号；而当PCR过程中TaqDNA聚合酶扩增到探针结合模版的位点时，其5'-3'核酸外切酶的活性（也就是切口平移）切割掉探针5'端的报告基团——游离的报告基团远离淬灭基团，打破能量的传递，激发报告基团产生的荧光信号就能够被荧光检测系统检测到。这样每扩增一条DNA链，就对应有一种游离的荧光分子（报告基团）形成，确保了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同时，因此对荧光信号进行检测就能够实时监控PCR的过程，精拟定量PCR的起始拷贝数。但是事实上探针较长使得两端基团距离较远，会造成荧光淬灭不彻底，并且淬灭基团也会产生不同波长的荧光，都会使得本底偏高.MGB技术原理：针对Taqman探针荧光淬灭不彻底的问题，美国ABI公司推出了一种新TaqMan探针——MGB探针（minorgroovebinderoligodeoxynucleotideconjugate,MGB-ODN)，3'端采用了非荧光性的淬灭基因——淬灭基团吸取报告基团的能量后并不发光，大大减少了本底信号的干扰。另外，MGB探针的3'端还连接了一种二氢环化吲哚卟啉-三肽(dehydrocyclopyrroindoletripetide,DPI3)，能够大大稳定探针与模板的杂交,升高探针Tm值,使较短的探针同样能达成较高的Tm值——而短探针的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近,淬灭效果更加好，荧光背景更低，使得信噪比更高：一种15bp的MGB探针的信噪比不不大于6,优于抱负状态下的25bp的普通Taqman探针（信噪比约为1.5）。允许采用更短的探针也简化了探针的设计和成本。有实验证明MGB探针对于等位基因的分辨比较抱负，甚至能够检测单碱基突变(由于碱基错配对较短探针的杂交稳定性影响更大)水解探针之因此称之为水解，重要是由于它运用的是Taq酶的水解作用，使得探针上的荧光报告基团远离淬灭基团而发光信号，游离的报告基团数目对应PCR新扩增产物，此办法检测的...