. . 原核表达详细步骤Part Ⅰ选择表达的目的基因一、 基因序列1. 得到靶基因 DNA（cDNA）序列，有几种方式寻找正确的读码顺序: ①利用生物信息学在NCBI上 blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的 ORF中找到正确的读码。②实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在DNA上找到正确的读码。③利用 mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子。在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子（cDNA）。2. 注意事项：①区别 ORF和 CDS→ORF一般在 DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是 DNA上的定义，也可以是 mRNA上的定义，分为 complete CDS和 partial CDS,是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS 读码是“M、、、、、、、、、＊”，partial CDS的读码是相应的 AA ②在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。二、 抗原决定簇的预测1、原理：蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。一般抗原决定簇是由 6－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。 只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来， 如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。2、选择原则 ：（1）、亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。（2）、 处于结构表面 ：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。（3）、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。所以一般来说蛋白质的 N 端及 C 端是很好的抗原决定簇区域。3、选定抗原决定簇的步骤：（1）预测 ：如软件预测 DNAstar（Protean ）预测， Dnaman。在线网站预测（http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/index.shtmland http://www.imtech.res.in/raghava/propred/algorithm.html）（2）选定：接近 N、C端；选取在此区间内， （Antigenic Index ）Jameson-wolf抗原决定簇选正分高处；（Hydrophilicity plot ）Kyte-Doolittle预测亲水性强的区域。同时符合以上3 点的区域较好（命名为多肽片断A）。注：如果设计的多肽是跨膜蛋白，请尽量回避选择蛋白的跨膜区，即头端信号肽所在的区域（3）N...
