DIG 检测试剂盒疑难问题及解决方案 一、灵敏度低或信号弱的问题及解决方案？ 1 . 探针标记效率低： 2 . 膜的问题：使用阳性尼龙膜 3 . 杂交：增加标记探针的浓度，或减少洗涤时的严谨性 4 . 曝光时间：增加曝光时间；使用高灵敏度的专用化学发光的 Lu mi-Film 胶片，其他像 Kodak XAR 也可。 二、高背景解决方案? 1 . 探针标记：纯化的 DNA 或 RNA 在标记前用乙醇沉淀；确认探针对靶序列是特异性并跟其他载体无同源性； 2 . 膜：推荐使用罗氏或经过验证的膜(pall)、Ambion 膜 3 . 杂交：使用 CDP-Star 发光底物，最好将 DIG 探针浓度稀释到（RNA 20-50ng/ml） 另外在杂交过程中不要让膜干燥 4 . 检测过程：将抗 DIG-AP 的酶的浓度到由原来的 1:20,000 减少到 1:50,000，也不会减少酶检测的灵敏度。增加洗脱和封闭的溶液的量和次数；膜上出现斑点可能是由于酶在膜上的凝集，需要将膜短暂离心后使用。 5 . 曝光时间：缩短曝光时间，通常为15-60s。 Ambion 生物素化探针疑难问题解决方案 一、探针类型、设计及标记方法 （一）探针类型如何选择？ 1.单链 DNA 探针：对于传统的杂交缓冲液，单链探针的效果要好于双链探针，因为双链探针可与未标记的 RNA 结合，降低了探针与靶 RNA 结合的浓度，使杂交信号减少，另外双链探针之间可以退火，降低探针的浓度。 1 ) 引物延伸法：质粒克隆或 PCR 产生的模板 2 ) 非对称扩增 PCR: 3 ) 末端标记的寡核苷酸；优点:简单、经济，对于同源性较高的序列或对靶基因序列了解较少情况下适用。通常在 5’末端用多聚核苷酸激酶标记，但每一个分子仅有一个可标记的基团，比内部掺入标记的探针灵敏度更低，且杂交温度需要去摸索。 2.双链 DNA 探针：有高度特异性，能用于随机引物进行标签，快速和可靠。缺点是;在杂交前需要变 性。 3.RNA 探针：质粒克隆表达或 PCR 产生的 DNA 模板进行体外转录合成 RNA 探针。 （二）探针设计原则; 1.探针需在反义链上：才能跟 mRNA 互补,启动子应在 3’末端编码区 。双链 RNA 探针需含有意义链和反义链。合成单链探针时要考虑合成的是反义 RNA，启动子应在 3’末端。下图示意选择启动子的位置;在反义链 3’端使用启动子 1 产生的正义 RNA 探针，在反义链 5’端使用启动子 2 产生的反义链 RNA 探针。 2.探针长度：在 100-1000 之间，大于 1000 则产生高背景,很难区分异...
