RNA 提取及反转录合成cDNA 具体实验步骤由 杨盛于 2011/6/8 12:56 创建一、 RNA提取前的准备RNA制备的关键是要抑制细胞中的RNA分解和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。因此，在实验中必须采取以下措施：1、戴一次性手套；2、使用 RNA操作专用实验台；3、在操作过程中避免讲话等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。二、使用器具尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理：1、用 0.1%DEPC水溶液在 37℃下处理 12小时，2、然后在 120℃下高温灭菌 30min 以除去残留的 DEPC，（ RNA实验用的器具建议专门使用，不要用于其他实验。）三、 试剂配制用于 RNA实验的试剂，须使用干热灭菌（180℃，60min）或使用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装 （也可以使用 RNA实验用的一次性塑料容器） ，使用的无菌水需用 0.1%的 DEPC处理后再进行高温高压灭菌。RNA实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。四、实验操作在研磨样品前，先把所要用到的试剂和枪头、研钵（未拆开报纸）放在超净工作台上，打开紫外灯照射20-30min 杀菌。1. 50-100mg的普通组织样品： RNAiso Plus 1ml2. 试验样品的研磨和匀浆（1）将超低温冻结的 RNA提取样品称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研钵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状（无明显的课件颗粒，如果没有研磨彻底会影响RNA的收率和质量）。（研磨好的样品立即加入RNAiso Plus）（2）对于普通的 RNA提取样品，可以向研钵中加入适量的RNAiso Plus，将研磨成粉末状的样品完全覆盖，然后室温静置，直至样品完全融化，再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。（3）将匀浆液转移至离心管中，室温静置5min。（4）12000g 4℃离心 5min。（5）小心吸取上清液，移入新的离心管中（切勿吸取沉淀 ）。3.Total RNA 的提取（加入 RNAiso Plus 后，静置 5min，离心转移上清，避免未破碎的杂蛋白污染）（1）向上述步骤 2的匀浆裂解液中加入氯仿（RNAiso Plus 的1/5体积量），盖紧离心管盖，用手剧烈振荡15s（氯仿沸点低，易挥发，振荡时应小心离心管突然弹开）。待溶液充分乳化（无分相现象）后，再室温静置 5min。（2）12000 g 4℃ 离心 15min。（3）从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中（...
