引物合成常见问题Q1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种 , 无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。(1)去保护：加入Deblocking 脱去碱基上 5'- OH 的保护基团DMT ，获得游离的 5'- OH ；(2)耦合：同时加入活化剂和新的碱基，新的碱基5'-OH 仍然被 DMT 保护， 3'端被活化与溶液中游离的5'-OH 发生耦合反应；(3)封闭：耦合反应中极少数5'- OH 没有参加反应，用封闭试剂终止其后继续发生反应；(4)氧化：加入氧化剂使其由核苷亚磷酸酯形成更稳定的核苷磷酸酯。Q2.引物合成如何处理？切割与脱保护基：将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来。常用新鲜的浓氨水来裂解CPG与初始核苷之间的酯键。断裂下来的寡核苷酸带有自由的3’羟基。纯化： 根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯化的方法。常用的纯化方法有：C18、OPC、PAGE和 HPLC。定量：根据寡核苷酸在260nm处的紫外吸收来定量。储存：分装抽干。Q3.合成的引物 5’端是否有磷酸化？合成的引物 5’为羟基，没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5’端磷酸化，或者要求我们合成时直接在 5’或3’端进行磷酸化，需要另外收费。Q4.需要什么级别的引物？根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。应用引物长度要求纯度级别要求一般 PCR扩增< 60baseHEPD>60 basePAGE诊断 PCR扩增< 40baseHEPD , PAGEDNA测序20base 左右HEPD亚克隆，点突变等根据实验要求定HEPD , PAGE，HPLC基因构建（全基因合成）根据实验要求定HEPD PAGE反义核酸根据实验要求定HEPD PAGE修饰引物根据实验要求定PAGE, HPLCQ5.需要合成多少OD数？根据实验目的确定。一般PCR扩增， 2 OD引物，可以做 500-1000 次50ul 标准 PCR反应。如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了。Q6.如何计算引物的浓度？引物保存在高浓度的状况下比较稳定。一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成100pmol/ul ，称为保存浓度，而引物的工作浓度一般配制成10-50pmol/ul。加水的体积（微升）可直接参照合成报告单上推荐的体积，也可按下列方式计算：V ( 微升 )= OD 数 x 33 x 10000 /引物的分子量引物的分子量可以从合成报告单上获得。注意：1 OD260= 33 ug/ml。溶解前您需要核对合成报告单和引物标签上的引物OD数是否一致。 如果不一致， 请和我们联系。 我...
