基因组DNA的提取与分离VIP免费

实验1大肠杆菌基因组DNA的提取与分离鉴定基因组是指细胞内遗传信息的携带者DNA的总体。为了研究DNA分子在生命代谢中的作用，常常需要从不同的生物材料中提取DNA。由于DNA分子在生物体内的分布及含量不同，要选择适当的材料提取DNA。从各种材料中提取DNA方法不同，分离提取的难易程度也不同。真核生物的DNA主要存在于细胞核中，与蛋白质结合构成染色体，原核生物的DNA不与任何蛋白质结合。理论介绍一、内容提要小牛胸腺肝脏鱼类精子幼苗种子胚胎谷氨酸菌体（7%~10%）面包酵母（4%）啤酒酵母（6%）大肠肝菌（9%~10%）来源动物植物微生物许多病毒的DNA分子长度超过100kb，细菌DNA为几千kb，高等动植物的基因组DNA长度达到上亿kb。保持基因组DNA结构相对完整：防止各种因素引起的降解。纯度高：尽量排除其他大分子成分的污染（蛋白质、多糖和RNA等）。得率好：选用合适的方法获得足够量的DNA。二、分离纯化核酸的总原则三、基因组DNA提取的原理裂解细胞，释放DNA核酸分离纯化沉淀并吸附核酸核酸溶解（缓冲液）准备适宜的材料去除蛋白质、RNA等杂质细胞破碎细菌—溶菌酶（降解细胞壁），EDTA（抑制DNA酶，防止DNA降解），去垢剂SDS（破坏细胞膜）酵母—破壁酶或液氮研磨植物材料—液氮研磨（使细胞冻结，用研钵碾制成粉状）动物组织—匀浆或液氮研磨化学法、机械法、生物法DNA与蛋白质的分离SDS：真核生物的DNA与组蛋白结合形成DNP，SDS能够破坏DNA与蛋白质之间的静电引力或配位键，可使DNA与蛋白质解聚，释放出DNA。CTAB：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，能与核酸形成复合物，在高盐溶液（NaCl>0.7M）中是可溶的，当NaCl降低到0.3M时，可沉淀CTAB-核酸复合物。（植物）苯酚-氯仿-异戊醇：苯酚、氯仿能变性蛋白质，离心分层，DNA溶于上层水相，变性蛋白质位于水相和有机相之间。异戊醇可减少抽提过程的泡沫产生。1.DNA与蛋白质的分离2.蛋白质的去除核酸分离纯化RNA的去除用不含DNA酶的RNase处理，使RNA降解。添加RNase处理后，可再用等量的苯酚/氯仿抽提，离心除去蛋白质及寡核苷酸。核酸分离纯化含DNA的水相可用1倍体积的异丙醇或2倍体积的无水乙醇沉淀。基因组的大分子DNA沉淀形成纤维状絮团漂浮其中，可用吸头将其挑出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附在壁上及底部。如果DNA沉淀量少或无法捞出，可离心获取沉淀。沉淀DNA前，为提高沉淀效果，可加入NaAC、乙酸铵等盐类促进沉淀。获取的沉淀需再用70%乙醇洗涤除去残留的有机物、无机盐等。沉淀并吸附核酸基因组DNA提取注意事项使用新鲜、幼嫩的材料；材料应适量，过少造成核酸提取量少，过多影响裂解，导致DNA量少。（推荐2-4mL）。简化操作步骤，缩短提取过程，避免物理、化学和生物的因素对核酸的降解，如机械剪切力、高温和DNase等酶，防止过酸、过碱，避免剧烈振荡和混合。采用酚-氯仿抽提时应采用上下颠倒的方法充分混匀，但动作要轻柔，离心分离两相时，应保证一定的转速和时间。沉淀DNA用的异戊醇、乙醇事先放入-20℃冰箱，待用时取出。四、实验步骤本试剂盒采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统提取细菌的基因组DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料为新型材料，能够高效、专一吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。提取的基因组DNA片段大，纯度高，质量稳定可靠。五、琼脂糖凝胶电泳法测定DNA分子大小电泳（electrophoresis）是荷电溶质或粒子在电场作用下发生定向泳动的现象。核酸的分离和鉴定通常采用琼脂糖凝胶电泳。不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。琼脂糖凝胶电泳分离后的DNA可用溴化乙啶（EB）染色。详见实验课件：DNA的琼脂糖凝胶电泳图1E.coliJM109基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图