菌种保藏及活化菌种保藏的原理和方法一、菌种保藏的目的保存、不退化二、菌种保藏的原理DNA复制时自发突变是造成菌种退化的原因，因此要创造代谢不活泼的状态。休眠态（孢子、芽孢）代谢不活泼的状态环境（干燥、低温、缺氧、缺营养）斜面保藏法和穿刺保藏法沙土管干燥保藏法真空冷冻干燥保藏法液氮保藏法悬液保藏法低温保藏法三、菌种保藏的方法一种良好的菌种保藏方法，首先应保持原菌优良性状长期稳定，同时还应该考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性。具体的方法很多，现把多种方法按类排列后作一综合性表解，以便读后有一全面了解。（1）斜面保藏法：是一种短期、过渡的保藏法，用新鲜斜面接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满后，放在4℃冰箱保存（过低，会结冰；太高，达不到保存目的）。保存期一般为3~6月。注意点：（1）水分：用牛皮纸避免水分蒸发，或用橡皮塞（2）培养基：专门设计的培养基，营养相对不太丰富（3）微生物状态：孢子或芽孢长好后，再保藏，不易退化（4）温度：4℃冰箱保存（过低，会结冰；太高，达不到保存目的）（2）穿刺保藏法：（略）1、斜面保藏法和穿刺保藏法2.沙土管干燥保藏法（略）3.真空冷冻干燥保藏法是目前常用的较理想的一种方法。其基本原理是在较低温度下，（-18℃），快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。在这样的环境中，微生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异。一般可保存5~10年左右。4.液氮保藏法是适用范围最广的微生物保藏法，其保存期最长。因为液氮的温度可达-196℃，远远低于菌种新陈代谢作用停止的温度（-130℃），故此时代谢活动已停止。保藏期一般为2~3年，长的可达9年之久。5.悬液保藏法（略）6.低温保藏法四、菌种保藏的共同注意点•1、严格的无菌操作；•2、用于保存的微生物在生长前必须处于它生长良好的状态；•3、保藏过程中要防止退化的发生（不同的保藏方法，分别有不同的保存时间。）五、与菌种保藏相关的几个概念•1、活化：把微生物从保藏斜面转接到活化斜面上，使其活性得以恢复。相对而言活化斜面培养基中的营养丰富些。保藏斜面→活化斜面2、复壮：使微生物活性恢复的同时，恢复其优良的生产性能。保藏斜面→平板分离（自然分离，剔除退化菌种）→活化斜面六实验步骤（一）实验所需物品：•1.仪器：霉菌培养箱、恒温摇床•2.玻璃器皿：50ml三角瓶、9cm培养皿。•3试剂：丙三醇（甘油）、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、氨苄青霉素、卡那霉素。•4.其他：移液枪、枪头、1.5ml离心管。（二）实验准备工作：1、配制LB培养基（1L）胰蛋白胨10g酵母提取物5g氯化钠10g固体培养基需加入琼脂粉18g（夏季）或15g（冬季），高压灭菌，备用。2、将培养皿、锥形瓶、枪头、离心管等高压灭菌。3、氨苄青霉素、卡那霉素过滤除菌分装放在1.5ml离心管内，—20℃保存。4、（三）操作步骤：1、菌株活化:在无菌操作下(1).手持金属接种环，用酒精灯将接种环（共约5公分）烧至火红，并不断来回烧烤金属固定杆之前约10公分，等待约10秒钟，将接种环前端轻触培养基边缘凝胶（无菌体部份），待接种环完全冷却后，以环沾黏菌滴，由培养基边缘向中央轻轻横划紧接的并行线，直到涵盖1/3培养基为止（I区）。(2).旋转培养基自I区涂布的边缘再横划数条线到未接种的区域（II区）。(3).重复步骤(2)的动作完成III区与IV区(4).灼烧接种环，将接种环归位。(5)将接种好的培养基置于指定温度的培养箱中培养。图示:A、金属接种环B、平板划线法2、菌种保存：在无菌操作下(1)挑取活化所得的菌板上的单个菌斑培养，用3ml液体LB培养基（卡那或氨苄抗性）在7ml离心管内，37度摇床培养过夜。(2)用移液枪吸取得到的一定浑浊度的菌液800微升和200微升丙三醇加入1.5ml离心管中，混匀。-80度保存。3.注意事项：(1).用移液枪时枪杆千万不要触碰器皿内壁，触碰会引起不必要的污染。(2)吸取液体时千万不要将液体吸入移液枪内，万一吸入不要将液体再打回器皿内，应丢弃。更换移液枪或控干移液枪，然后在使用。(3)画板时动作要快且轻柔。动作太重会将培养皿中的培养基划破，不利于菌生长。动作太慢会有沉降菌进入培养皿中，引起不必要的污染。Thanks
