杀菌和抑菌试验制作人：质量人一、总则适用范围：本方法适用于医疗、卫生、食品等行业的杀菌和抑菌试验。引用标准：消毒技术规范2002二、术语消毒disinfection杀灭或清除传播媒介上病原微生物,使其达到无害化的处理。灭菌sterilization杀灭或清除传播媒介上一切微生物的处理。消毒剂disinfectant用于杀灭传播媒介上的微生物使其达消毒或灭菌要求的制剂。灭菌剂sterilant可杀灭一切微生物(包括细菌芽孢)使其达到灭菌要求的制剂。二、术语杀灭时间killingtime,KT用于生物指示物抗力鉴定时,指受试指示物样本，经杀菌因子作用不同时间后,培养后的全部样本均无菌生长的最短作用时间(min)杀灭率killingrate,KR在微生物杀灭试验中，用百分率表示微生物数量减少的值，以其表达杀灭效果。灭对数值killinglogvalue微生物数量以对数表示时，消毒后与消毒前比较,以其减少的对数值来表达杀灭效果。三、菌悬液与菌片的制备（一）、试验前应选择合适的细菌，在下述规定中表中‘+’为必做试验的微生物，根据消毒剂特定用途或试验特殊需要，还可增选其他菌株。金黄色葡萄球菌绿脓杆菌大肠杆菌白色念珠菌枯草杆菌黑色变种芽孢手皮肤和粘膜++++空气+医疗器械和用品++++一般物品表面和织物+食(饮)具++饮水和游泳池水+三、菌悬液菌片的制备（二）、试验器械A.无菌蒸馏水B.细菌培养基：胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA），胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）和营养肉汤培养基等C.刻度吸管（1.0ml、5.0ml、10.0ml），毛细吸管。D.数字可调移液器（10μl~200μl）及配套用一次性塑料吸头。E.浊度计。F.游标卡尺。三、菌悬液菌片的制备（三）、细菌繁殖体悬液的制备1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含5.0ml～10.0ml营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37℃培养18h～24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于37℃培养18h～24h。挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，于37℃培养18h～24h，即为第3代培养物。2）取菌种第3代～14代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（18h～24h），用5.0ml吸管吸取3.0ml～5.0ml稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用三、菌悬液菌片的制备5.0ml吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合（振荡）20s，或在手掌上振敲80次，以使细菌悬浮均匀。3）初步制成的菌悬液，先用细菌浓度比浊测定法粗测其含菌浓度，然后以稀释液稀释至所需使用的浓度。4）细菌繁殖体悬液应保存在4℃冰箱内备用。应当天使用不得过夜。5）怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。四、菌片的制备程序1）滴染法染菌时，先用浊度计测定的菌悬液浓度，调至含菌量为1～5×108cfu/ml将经灭菌的载体片平铺于无菌平皿内，菌液滴加量每片为10μl。用10μl移液器接灭菌塑料吸头，滴染菌液，并用接种环涂匀整个载体表面。滴染菌液后，染菌载体可置37℃温箱内烤干（约20min～30min），或置室温下自然阴干后再使用。2）每个菌片的染菌量，即回收菌数，按活菌培养计数所得结果，应为5×105cfu/片～5×106cfu/片。3）配制菌悬液和制备菌片时，保持环境的洁净和安静，严格按无菌要求操作，以防污染杂菌，影响随后杀菌试验的结果。五、活菌培养计数技术1）取含5.0ml稀释液无菌试管，对菌片或小型固体样本直接投入即可，对棉拭则将其采样端剪入管内，每管一份样本。而后，用手掌上用力振敲80次，形成菌悬液。2）将试管按需要数量分组排列于试管架上，每管加入4.5ml稀释液。各组由左向右，逐管标上10-1、10-2、10-3......等。3）将菌悬液样本在手掌上用力振敲80次，吸取0.5ml加至10-1管内。4）将10-1管依前法在手掌上用力振敲80次，混匀，再吸取出0.5ml加入10-2管内。如此类推，直至最后一管。五、活菌培养计数技术5）选择适宜稀释度试管（以预计生长菌落数每平板为30cfu～300cfu者为宜），吸取混合均匀的悬液1.0ml加于无菌平皿内。每一稀释度接种3个平皿。需接种2个～3个不同稀释度。6）将冷至40℃～45℃的熔化营养琼脂培养基，倾注于已加入样液的平皿中，每平皿15ml～20m...
