解惑练4 PCR 技术拓展应用 应用1：反向PCR 测定未知DNA 区域 当DNA 的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR 技术
原理：用限制性内切核酸酶切割该DNA，随后使用DNA 连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA 分子
以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列
应用2：PCR 定点突变技术 该技术要使用四条引物
其中引物2 和3 的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的
因此，分别利用引物1 和2，引物3和4 进行PCR 后，得到的DNA 片段可以通过引物2 和3 互补的碱基杂交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA 片段
最后，用引物1 和4 进行扩增得到含有突变位点的DNA 片段
通过测序可以检验定点突变是否成功
应用3：(实时)荧光定量PCR(RT－PCR) 先从样本中提取RNA，RNA 中可能有新冠病毒的RNA，同时也存在很多采样患者的组织和存在于采样部位的微生物的RNA
通过逆转录酶将样本的RNA 逆转录为cDNA，并进行PCR 扩增，在PCR 反应体系中，包含一对特异性引物以及一个Taqman 探针，该探针为一段特异性寡核苷酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；若反应体系存在靶序列，PCR 反应时探针与模板结合，DNA 聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针降解，报告基团与淬灭基团分离，发出荧光
每扩增一条DNA 链，就有一个荧光分子产生
荧光定量PCR 仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct 值)与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，Ct 值越小(如图)
