解惑练4 PCR 技术拓展应用 应用1：反向PCR 测定未知DNA 区域 当DNA 的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR 技术。原理：用限制性内切核酸酶切割该DNA，随后使用DNA 连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA 分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。 应用2：PCR 定点突变技术 该技术要使用四条引物。其中引物2 和3 的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。因此，分别利用引物1 和2，引物3和4 进行PCR 后，得到的DNA 片段可以通过引物2 和3 互补的碱基杂交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA 片段。最后，用引物1 和4 进行扩增得到含有突变位点的DNA 片段。通过测序可以检验定点突变是否成功。 应用3：(实时)荧光定量PCR(RT－PCR) 先从样本中提取RNA，RNA 中可能有新冠病毒的RNA，同时也存在很多采样患者的组织和存在于采样部位的微生物的RNA。通过逆转录酶将样本的RNA 逆转录为cDNA，并进行PCR 扩增，在PCR 反应体系中，包含一对特异性引物以及一个Taqman 探针，该探针为一段特异性寡核苷酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；若反应体系存在靶序列，PCR 反应时探针与模板结合，DNA 聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针降解，报告基团与淬灭基团分离，发出荧光。每扩增一条DNA 链，就有一个荧光分子产生。荧光定量PCR 仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct 值)与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，Ct 值越小(如图)。 跟踪训练 1．如图所示，在一段未知序列的突变体DNA 片段中，插入了已知序列的T－DNA，要想对T－DNA 两侧的未知序列进行测序，下列做法正确的是( ) A．用引物①和引物④直接进行PCR 扩增之后再测序 B．用引物②和引物③直接进行PCR 扩增之后再测序 C．用DNA 连接酶连接成环状后，再用引物①④PCR 扩增后测序 D．用DNA 连接酶连接成环状后，再用引物②③PCR 扩增后测序 答案 C 解析 直 接 选 用 引 物 ①、④组 合 进 行 PCR， 引 物 选 择 方 向 相 反 ， 无 法 完 成 扩 增 ， A 错 误 ； 用引 物 ②和 引 ...
