RNA-Seq 数据分析 从原始的数据开始，进行reads 回帖，到拼接转录本，计算表达量，分析差异表达，最后可视化分析结果。 TopHat 是一 个把 reads 回帖到基因组上的工具。首先用 Bowtie 把 reads回帖到基因组上，然后通过拼接，我们就可以在基因组上看到一些 reads 堆叠起来的 区域，称为 consensus,这些 consensus 可能是一个真的外显子，也有可能是几个外显子拼在一起的，或者一些别的情况。我们知道，经典的剪切 位点一般都有GT 和 AG 这样的序列标志，在 consensus 的边界和内部，TopHat 会去找这样的剪切位点，并且得到他们可能的组合。然后对于那些没 有被 Bowtie 贴到基因组上的reads,TopHat 会对他们建立索引，去和这些可能的剪切位点比对，这样就把跨越剪切位点的reads 准确地贴到基 因组上。 一些比较重要的命令行选项。 关于插入片段长度的选项：在RNA-Seq 中，会把mRNA 打断成小的片段，然后对片段长度进行iding 筛选后拿去测序，如果选择的片段长度是300bp，两端各测序75bp 的reads,中间的插入片段长度就应该设为150bp. 下面是设置插入片段长度的标准差，如果选择的片段长度比较集中，这个值可以设置的小一些，反之应该设置得大一些。 -G 选项是提供哦呢一个已有的注释文件。如果你分析的基因组被注释得比较好了，最好能够提供这个文件， 这时 TopHat 就会先把reads 往转录组上贴，没有贴到转录组上的再往基因组上贴，最后把结果合并起来。我们知道大多数的转录组都是比基因组小得多的，而且junction reads 可以直接贴到转录本上，所以这样回帖的效力和准确度都可以 得到提高。 标准的Illumina 平台是不分链的，我们无法知道配对的reads 哪个方向和转录本一致，哪个和转录本反向互补。对于分链的数据，也有两 种情况，在firststrand 这种分链方法中，第二个read 和转录本方向一致，第一个read 和转录本反向互补，在另一种fr- secondstrand 分链方法中，就刚好反过来了。所以在分析的时候一定要弄清楚自己的数据有没有分链，是怎么分链的。 下面是一个模拟的RNA-Seq 数据集，双端测序，有两种处理 ，每 种处理 有 3个重 复 ，这里 C 代 表 处理 ，R 代 表 重 复 ，下面用C1R1 进行演 示 首先，要有参考序列fasta 文件，也就通常说的基因组序列。 TopHat 是利用 Bowtie2 回帖 reads,我们首先需要建立 Bowtie2 的索引文件： bowtie2-build genome....
