实 验 一 大 肠 杆 菌 感 受 态 细 胞 的 制 备 及 质 粒 转 化 【 实 验 目 的 】 熟 悉 利 用 CaCl2 法 制 备 大 肠 杆 菌 感 受 态 细 胞 的 操 作 及 质 粒 转 化 大 肠 杆 菌 的 方 法 。 【 实 验 原 理 】 当 大 肠 杆 菌 生 长 到 OD600 约 为 0.2~ 0.4 时 ，用 冰 冷 的 氯 化 钙 低 渗 溶 液 处 理 大 肠 杆 菌 细 胞 ，细 胞 膨 胀 成 球 形 ， 可 使 大 肠 杆 菌 进 入 一 种 易 于 接 受 外 源DNA 的 状 态 （ 感 受 态 ）， 处 于 此 状态 的 细 胞 称 为 感 受 态 细 胞 （ competent cells）。 此 时 ， 若 在 感 受 态 细 胞 中 加 入 质 粒 ， 则 质 粒DNA 与Ca2+形 成 的 复 合 物 粘 附 于 细 胞 表 面 ， 经 过42℃ 短 暂 的 热 激 处 理 后 ， DNA 与Ca2+形成 的 复 合 物 进 入 大 肠 杆 菌 细 胞 ， 在 不 含 抗 生 素 的 培 养 基 中 短 暂 培 养 ， 使 转 入 大 肠 杆 菌 质 粒 上的 抗 生 素 抗 性 基 因 表 达 ， 在 含 相 应 抗 生 素 的 选 择 培 养 基 上 可 将 转 化 菌 （ 含 质 粒 ） 与 未 转 化 细菌 分 开 ， 转 化 细 菌 经 过 不 断 分 裂 增 殖 形 成 菌 落 ， 而 未 转 化 的 细 菌 则 不 能 。 【 器 材 与 试 剂 】 1． 实 验 仪 器 培 养 箱 ， 恒 温 摇 床， 超净工作 台， 低 温 台式离心机， 分 光光度计， 水浴锅，高压灭菌 锅， 微孔滤器 （ 含 0.22μm 滤膜）， 酒精灯 2． 实 验 试 剂 氯 化 钠（ AR）， 无水氯 化 钙 （ AR）， 蛋白胨， 酵母提取物 ， 1.0 mol/L NaOH，氨苄青霉素 钠， 琼脂粉， LB 液 体培 养 基 ：蛋白胨10 g， 酵母提取物 5 g， NaCl 10 g， 800 mL蒸馏水溶 解后 ， 用 NaOH 溶 液 调pH 至7.0， 蒸馏水定容至1 000 mL， 121℃ 高压灭菌 20 min； LB 固体培 养 基 ：蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g， 800 mL 蒸馏水溶 解后 ，用 1.0 mol/L NaOH 调pH 至7.0， 蒸馏水定容至1 000 mL， 然后 加 入 琼脂粉15 g， 121℃...
